Name: から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -と p53の - / -マウス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 59 s
Description: 学ぶマウス胸腺リンパ腫細胞株の確立プロトコル。ATMとp53欠損マウスからT細胞株を導出し、腫瘍生物学とがん治療標的の研究に活用する方法を解説します。

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著者らは、有用な議論をコロンビア大学で微生物学免疫学教室から博士ボリスReizisに感謝したい。我々はまた、フローサイトメトリーおよびビデオ編集の支援のための陸黄との技術援助のために獣医学部の大学、コーネル大学で微生物学免疫学専攻から博士マーガレットバイノー、博士ロッドマンゲッチェルとDeequa Mahamedに感謝したい。 - / -マウス著者らはまた、p53を繁殖し、遺伝子型決定のためにワイス研究所からその重要な原稿や映像制作の見直し、そしてステファニーYazinskiためデュアメルとワイスの研究室のメンバーに感謝したい。動物実験は、コーネル大学動物実験用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。この研究は米国農務省、協同組合の国家研究、教育、および拡張サービス、動物の健康と疾病の研究プログラム（GEDおよびRSWに）とNIHの助成金R03 HD058220とR01CA108773（RSWまで）で提供される資金によって部分的にサポートされていました。ビデオはデュアメル＆ヴァイス研究所から担当者が社内の設備を用いて作製した。

1。腫瘍の解剖<ol><li>腫瘍切開の場合は、きれいなペーパータオルや使い捨て外科用ドレープは、解剖のパッド上に配置され、70％エタノールを噴霧。 </li><li>このプロトコルのためのマウスは、定期的にCO 2で安楽死されています。解剖パッドで安楽死させたマウスを重ね、エタノールで動物の両面をスプレー。マウスは足を通して挿入し、70％エタノールで十分に噴霧し、4つ以上のプッシュピンを使用して解剖のパッド上に固定されています。 </li><li>正中線上の皮膚が下層にある筋肉を回避し、体腔内に浸透しながら、滅菌済みのハサミを使って、恥骨から頭のベースにカットされます。 </li><li>内臓を損傷しないように注意して滅菌済みのハサミとピンセットの新しいペアと腹腔を開きます。 </li><li>血管を傷つけることなく、腫瘍を明らかにするために胸郭を解剖し、偏向して胸腔を開きます。 </li><li>他の臓器から腫瘍を分離し、冷PBSに合計腫瘍（約最大1.5 × 0.8 × 0.8センチ）の約40〜50％の部分を転送するには、氷上で保存。 </li><li>腫瘍の残りの部分は、他のアッセイのために保存することができ、完全な剖検は、この時点で行うことができます。 </li></ol> 2。培養リンパ腫細胞<ol><li> 70％エタノールとバイオセーフティキャビネットへの転送で切除した腫瘍を含むチューブをスプレーしてください。 </li><li>無菌150ミリメートル2ペトリ皿に培地10mLを追加します。 </li><li>ピペットで穏やかな吸引により、シャーレに腫瘍の一部を譲渡する。 </li><li>斜めの面を外向きtwo滅菌18ゲージの針を曲げます。 </li><li>曲がった針を用いて腫瘍を取り除きます。 </li><li>渦巻料理は、優しくタップして、腫瘍の大部分を回避しながら、側に細胞懸濁液を収集するために斜めに置きます。 </li><li>腫瘍の大部分を回避しながら、50 mLコニカルチューブに細胞懸濁液と転送を吸引除去する。 </li><li>腫瘍の大部分を回避しながら、同じチューブに培地と転送10mLでプレートを洗浄してください。 </li><li>優しくリンパ球とストローマ細胞から成る細胞懸濁液を混合し、T - 75組織培養フラスコにT - 25組織培養フラスコ、10 mLに5 mLを転送する。優しくスワールフラスコを。 </li><li> 2.5mLの最終容量（培養容器のいくつかのタイプを使用して異なる密度で細胞を培養T細胞ラインを確立するの尤度を最大）に2、4、10100、1000倍希釈液を作るために、残りの細胞懸濁液を使用してください。 </li><li> 6ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ希釈のプレート2.0 mLを。優しくスワールプレートを。 </li><li>空気中の加湿CO 2雰囲気下で48時間細胞をインキュベートする。 </li></ol> 3。摂食リンパ腫細胞<ol><li>インキュベーションの48時間後、細胞の軽微な障害を持つ壁に沿ってT - 75フラスコに、T - 25フラスコおよび培地10mLに培地5mLを加える。 </li><li>細胞の軽微な障害を持つ壁に沿って6ウェルプレートの各ウェルに培地2 mlを加え。 </li><li>追加の72時間細胞をインキュベート</li></ol> 4。リンパ腫細胞を継代<ol><li>最初の一節<ol><li>オリジナルのフラスコやプレートを（最初の継代の間に約3x106 / mLの濃度で細胞密度を維持するのに成功確立を促進維持しながら、インキュベーション5日目の終わりに、細胞は、1:1の比率で継代されています連続的な細胞株）。 <ol class="lalpha"><li> T - 25フラスコは、培地5 mLを含む新しいフラスコに細胞懸濁液5 mLを転送する。オリジナルのフラスコに培地5mLを追加。 </li><li> T - 75フラスコは、培地10 mLを含む新しいフラスコに細胞懸濁液10mLを転送する。オリジナルのフラスコに培地10mLを追加。 </li><li> 6ウェルプレートの場合は、各ウェルに培地2mLを含む新しいプレートの対応するウェルに各ウェルから細胞懸濁液の2 mLを転送する。オリジナルのウェルの各ウェルに培地2 mlを加え。 </li></ol></li><li>追加の72時間のすべてのフラスコやプレートをインキュベート我々の経験ではほとんどの細胞系は、これらの通路one文化（添付のストローマ細胞上にゆるく付着懸濁細胞凝集体の存在が確立された細胞株の早期の指示である）から確立されています。 </li><li>より少ない、またはまったく緩く接着懸濁細胞凝集体との文化のために、慎重に培地ごとに72時間の約50％を置き換えることにより、フラスコやプレートを供給オリジナルの培養液から細胞を削除しないように、培養容器は、地位、上清培地の穏やかな吸引の前に重力により下部の細胞の沈殿をさせるには、少なくとも5分間静置されています。 </li></ol></li><li>樹立した細胞株の維持<ol><li>樹立した細胞株は、新しいフラスコやプレートに継代されています。 T - 25およびT - 75フラスコのため、オリジナルの5 mLを追加したり、培地5mLに通過oneサスペンション。 6ウェルプレートの場合は、T - 25フラスコに培地7mlの中にオリジナルまたは通過つのセルの懸濁液3 mLを加える。餌と新鮮な培養液で除去量に置き換えることによって、オリジナルまたは通路一つの文化を保持する。 </li><li>通路は、新しいT - 25フラスコに細胞株を確立した。細胞株は、18〜24時間の倍加時間を持っている文化は日常的に1 - 3x106 / mLの密度で維持し、3日毎に継代されています。 10mLに補うために新しい培地に、以前の継代培養の必要量を追加。フィードと独自の文化を保持。 </li><li>いくつかの継代後、非接着細胞は、自己接着性間質細胞なしで維持されると付着細胞のより小さい数は、各通路に引き継がれます。このポイントを超えて、文化は、T - 25フラスコを扱う非組織培養で維持することができます。 </li></ol></li></ol> 5。リンパ腫細胞株の凍結およびリカバリ<ol><li>細胞株は、20％FBS、10％のDMSOを含む新しく調製したRPMI 1640培地中で凍結されています。 </li><li> T - 25フラスコ（約1.5 × 10 6細胞/ mL）で48時間古い文化からの細胞を室温で5分間1500rpmで遠心分離されています。廃棄上清をした後、細胞を冷凍結培地2mlに再懸濁されている。各フラスコから細胞懸濁液の2つの1.0 mLのボリュームは、凍結バイアルに入れ、直ちに-80℃で凍結し、翌日、液体窒素に転送されます。 </li><li>細胞は急速解凍、そして新鮮な培地10mLに内容を再懸濁することにより、液体窒素貯蔵から回収されています。また、新たに解凍した細胞は、新鮮な培養液10mlに再懸濁する前に、DMSOを除去するために暖かい培地で一度洗浄されています。細胞は、その後の継代する前に少なくとも72時間培養する。 </li></ol> 6。代表的な結果 ATMは - / - T細胞ラインこのプロトコルを使用して開発し、指定さDWJ - ATM - 1は抗CD3 - FITC、抗CD4 - APCおよび抗CD8 - PEとフローサイトメトリー分析（図1）で染色することを特徴とした。 T -細胞の90％以上は、CD3、CD4およびCD8三重陽性であった。 <img src="/files/ftp_upload/2598/2598fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1は、このプロトコルを使用して開発されたT細胞ラインのキャラクタリゼーション。 / - -確立された櫃の細胞表面マーカーDWJ - ATM - 1、指定された細胞株は、抗CD3 - FITC、抗CD4 - APCで染色、抗CD8 - PEとフローサイトメトリー分析によって特徴づけた。簡単に言えば、1 × 10 6、新鮮な細胞は、（回転数1500rpm / 5分）冷PBSで一度洗浄し、4℃でインキュベートした抗体のカクテル（各抗体を1％BSAを含むPBSで1:200希釈で200μLの10分間。新鮮なまたは後の分析用に固定。固定細胞を4％（vol / vol）の最終濃度で加える中性緩衝ホルマリンで準備し、遠心分離により収集30分、（のために4℃でインキュベートしている間、細胞は、即時に取り調べることができる回転数1500rpm / 5分）と1％BSAを含むPBS 200μLで再懸濁し、1 × 10 4細胞の総数は、BD FACSキャリバーアナライザとCellQuestソフトウェア（BD Biosciences社、サンノゼ、CA）を用いて分析した。

<ol><li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm-deficient+mice%3A+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li>
<li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li>
<li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Atm-%2F-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li>
<li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li>
<li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li>
<li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL%2FLMO1+double+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li>
<li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li>
<li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルでは、我々は二つの異なるマウスの遺伝子型からマウスT細胞株を樹立するための詳細な手順を提供し、 - / - [FVB/N- 櫃tm1Led / J] と p53 - / -櫃 [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 。 / - -三（5回の試行のうち）p53の- / -このプロトコルは、6の合計（7回のうち）ATMを使って、マウスのT細胞株は、当研究室で確立されている。 / - -その細胞株DWJ - ATM - 1、 櫃を実証代表的なデータのセルラインは、細胞はCD3、CD4およびCD8表面マーカーの90％以上は、そのクローン性T細胞ラインは次のようにできることを確認した細胞集団で構成されています私たちのプロトコルを使用して確立。 <p class="jove_conte...

<ul><li>氷のバケット</li><li> 70％エタノール</li><li>アルミ箔と端子で覆われた発泡体のブロックで構成される解剖パッド</li><li>小さな滅菌済みのハサミとピンセットの二組</li><li>無菌150ミリメートル2シャーレ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、猫＃08-757-13。） </li><li>滅菌18ゲージの針</li><li> 50 mLコニカルチューブ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング、猫＃430829） </li><li> 10％緩衝ホルマリン</li><li>組織培養フラスコ<ul><li> T - 25（TPP、Trasadingen、スイス、猫＃90025） </li><li> T - 75（TPP、Trasadingen、スイス、猫＃90075） </li></ul></li><li> 6ウェルプレート（コーニング社、ニューヨーク州コーニング、猫＃3506） </li><li>滅菌リン酸緩衝食塩水pH7.2の（PBS）を</li><li>培地<ul><li> ：以下を補った、25mMのHEPES、200 mMのL -グルタミン（猫＃12 - 115Fロンザ、ウォーカー、MD）を含むRPMI 1640 <ul><li> 10％の熱不活性化（56℃、30分）ウシ胎児血清（FBS; Hyclone、ローガン、ユタ州、猫＃SH30088.03） </li><li> 1％のペニシリンとストレプトマイシン（Mediatech、マナサス、バージニア州、猫＃30 - 002 - CI） </li><li> 1パーセント非必須アミノ酸（Mediatech、猫＃25 - 025 - CI） </li><li> 55 mmの2β-メルカプトエタノール（シグマ、セントルイス、MO、猫＃M752） </li></ul></li></ul></li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO、カルビオケム、ラホーヤ、カリフォルニア州、猫＃317275） </li><li>抗体（eBioscience社、サンディエゴ、カリフォルニア州） <ul><li>抗CD3 - FITC（カタログ番号11-0031-85） </li><li>抗CD4 - APC（カタログ番号17-0041-83） </li><li>抗CD8 - PE（カタログ番号12-081-85） </li></ul></li><li>ウシ血清アルブミン（BSA、ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク;猫＃11018〜017） </li><li>コンカナバリンA（Sigmaカタログ＃C5275） </li><li> 1.8mlの凍結バイアル（Nunc社製、Roskilde、デンマーク、猫＃368632） </li></ul>

から胸腺リンパ腫のt細胞株の導出 atm - / -</supと p53の - / -</supマウス

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

確立された細胞株は、研究に実験動物の使用を減らすことができる重要な研究ツールです。特定のATMのような遺伝子改変マウスの系統、 - / - および p53 - / -は一貫して、人生の早い段階1,2の胸 ​​腺リンパ腫を開発し、その結果、マウスのT細胞株の導出のための信頼できるソースとして利用することができます。ここでは、前述のプロトコール1,3で説明されているインターロイキンを追加することなく、確立されたマウス胸腺リンパ腫のT細胞株の開発のための詳細なプロトコールを提示する。腫瘍が3〜6カ月歳のマウスから採取した、猫背の姿勢の観察に基づいて、目に見える腫瘍の最も初期に通知されたときに、貧しいグルーミングおよび感受性株の1,4の浪費、呼吸をこじつけ。 / - - [FVB/N- 櫃tm1Led / J] 2 と p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5匹のマウス我々は正常にこのプロトコルを使用していくつかのT -細胞株および ATMの近交系を確立している。我々はさらに確立されたT細胞集団の90％以上がCD3、CD4とCD8を発現していることを示しています。安定的に確立された細胞株と一致し、現在のプロトコルを使用して生成されるT細胞は、一年以上継代されています。

このビデオでは、マウス胸腺リンパ腫細胞株を確立するためのプロトコルを示す。およびp53 - / - - 胸腺リンパ腫を有するマウスはこのプロトコルに従うことによって、我々は成功したいくつかのATM - /からT -細胞株を確立している。

から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -</supと p53の - / -</supマウス

確立細胞株は、研究における実験動物の使用を削減できる重要な研究ツールである。遺伝子改変された特定の系統の...

このビデオでは、マウス胸腺リンパ腫を確立するためのプロトコルを実演します。細胞株について。可視腫瘍が認められた時点で、生後3か月から6か月齢のマウスから腫瘍を採取しました。前屈した姿勢、呼吸困難、グルーミングの悪化、および衰弱の観察に基づき、本プロトコルを用いて、いくつかのATM nullおよびP 53 null胸腺リンパ腫細胞株の樹立に成功しました。パート1では、腫瘍を担持したマウスから胸腺リンパ腫を採取する方法について説明します。本プロトコルに使用するマウスは、通常、二酸化炭素で安楽死させます。解剖パッドの上に清潔なペーパータオルを敷き、70% ethanolをスプレーします。安楽死させたマウスを解剖パッドの上に置きます。動物の両面にethanolをスプレーします。マウスを解剖台に固定し、70% ethanolを十分にスプレーします。滅菌済みのはさみとピンセットを用いて、体腔を傷つけないように注意しながら皮膚を切開します。新しい滅菌器具を用いて腹腔を開きます。臓器を損傷させないように注意してください。肋骨を解剖して開くことで胸腔を開き、血管を損傷させることなく腫瘍を露出させます。このマウスは、胸腔全体を占める十分に発達した腫瘍を有しています。腫瘍を他の臓器から分離し、腫瘍体積の約40〜50%に相当する断片を切り出します。切り出した腫瘍断片を冷PBSに移します。さらに別の腫瘍断片を採取し、10% formalinで固定します。組織学的解析のために、腫瘍の残りの部分を保存しても構いません。その他のアッセイについては、この時に合わせて他の臓器の検査および固定を行うことができます。本セクションでは、採取した腫瘍から胸腺リンパ腫細胞を培養する方法について説明します。摘出した腫瘍が入ったチューブを70%ethanolで洗浄し、組織培養フード内へ移します。滅菌済みのペトリ皿に10 millilitersの培養液を加えます。ピペッティングで穏やかに吸引し、腫瘍の断片をペトリ皿に移します。2本の滅菌済み18 gauge針を、針先（ベベル側）を外側に向けて配置します。曲げ針を用いて腫瘍片を解離させます。ディッシュをゆっくりと軽く回し、大きな腫瘍片を避けて細胞懸濁液を端に集めるように傾けます。細胞懸濁液を吸引し、50 milliliterのコニカルチューブに移します。大きな腫瘍片が混入しないように注意しながら、プレートを10 millilitersの培地で洗浄し、同じチューブに回収します。大きな組織片が入らないようにしてください。細胞懸濁液を穏やかに混合し、5 mLをT 25組織培養フラスコに移します。さらに10 mLをT 75組織培養フラスコに移します。残りの細胞懸濁液を用いて、2倍、4倍、10倍、100倍の希釈系列を作成します。各希釈液2 mLを6ウェルプレートの各ウェル

derivation-of-thymic-lymphoma-t-cell-lines-from-atm-and-p53-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM^{- / -と p53の^{- / -マウス}}

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