Name: 세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 배우세요 신경 콜로니 형성 세포 어세이를 사용하여 신경 전구 세포 혼합 집단에서 진정한 신경 줄기 세포의 빈도를 정량화하는 방법을 배우세요. 이 방법은 줄기 세포와 전구 세포를 구별하여 신경 발달 연구에 활용됩니다.

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1. 전지 도금을하기 전에 준비를해야 항목 : <ol><li> 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다. </li><li> 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 매체의 나누어지는가 해동됩니다. </li><li> 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다. </li><li> 표피 성장 인자 (EGF), 10 μg / 0.2 %에서 ML과 헤파린의 농도에서 기본 fibroblastic 성장 인자 (B - FGF)의 주식 솔루션은 미리 준비가되어 있습니다. </li><li> 실험의 크기에 따라 여러 35mm 조직 문화 요리 판 세포 하나 150-200cm 플라스틱 페트리 접시도 중복 35mm 요리를 개최하는 데 필요한 물을 위해 제 3 35mm 접시 필요합니다. </li></ol> 2. 셀 준비 : 실험에 따라 세포는 성인이나 배아 소스 (주 dissociated 조직 또는 dissociated neurospheres)에서 준비하실 수 있습니다. 성인 / 마우스 배아 중추 신경계 (CNS)에서 조직을 해부하다 또는 다음 1,2 앞에 설명한 배아 - 유래 / 성인 neurospheres을 떼어 놓다 : <ol><li> 단일 세포 현탁액은 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 전달되도록 같은 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거합니다. </li><li> 세포 현탁액의 10μl는 셀 카운트를 수행하는 Trypan 파랑의 90μl와 혼합됩니다 참고 :. 기타 적절한 세포 dilutions도 사용할 수 있습니다. </li><li> 기본 배아 또는 성인 파생된 신경 세포를 사용하는 경우, 전체 NSC 매체 6.5 X 10 5 세포 / ML의 농도로 세포 현탁액을 희석. 성인이나 배아 신경 세포에서 파생된 dissociated neurospheres의 세포를 사용하는 경우, 전체 NSC 매체에서 2.2 × 10 5 세포 / ML의 농도로 세포 현탁액을 희석. </li></ol> 3. 세미 솔리드 N - CFCA 매체에 도금 셀 : <ol><li> 다음과 같은 구성 요소의 적절한 볼륨 복제의 숫자에 따라 순서에 혼합됩니다. 여기 복제 두 필요한 금액을 혼합하거나 요리를 중복. 복제의 추가 숫자, 표 1을 참조하십시오. <ul><li> 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 매체의 1.7 ML </li><li> NeuroCult NSC 확산 보조 식품의 330 μL </li><li> EGF의 6.6 μL (10μg/mL) </li><li> 페니실린 / 스트렙토 마이신의 32 μL </li><li> B - FGF (10μg/mL)의 3.3 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. </li><li> 헤파린 (0.2 %)의 3.3 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. </li><li> 세포 현탁액의 25μL (dissociated neurospheres 또는 6.5 X 10 5 셀 / dissociated CNS 조직에서 ML 기본 세포에서 2.2 X 10 5 셀 / ML 세포) 참고 :. 도금 최종 셀 번호는 35mm 문화 요리 당 2500에 대한 셀해야합니다 neurosphere 파생된 세포 및 기본 세포 35mm 문화 요리 당 7,500 전지. 어떤 경우에는, 최종 세포 도금 밀도는 셀 적정 실험을 수행하여 조정되어야한다. 150 식민지 - 통계 분석을 위해, 문화, 21 일 후에 감지된 식민지의 총 개수는 적어도 50의 범위 내에서하여야한다. </li></ul></li><li> 세포를 포함하는 매체는 추운 콜라겐 솔루션의 1.3 ML이 세포 현탁액에 전송하고 거품을 도입 피하기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 혼합됩니다 부드럽게 그리고 혼합이다. </li><li> 혼합 솔루션은 각각 35mm 문화 요리 (~ 1.5 ML / 요리)의 중심에 적절하고 요리는 부드럽게 혼합이 접시의 표면 위에 균일하게 분산하도록 원형 운동을 사용하여 밀고있다. . </li><li> 중복 35mm 문화 요리는 100mm 페트리 접시에 게재됩니다. 새로운 35mm 요리의 뚜껑을 제거하고 열려있는 요리도 동일한 100mm 페트리 접시에 배치됩니다. 멸균 물이 부화 기간 동안 최적의 습도를 유지하기 위해이 열려 35mm 요리에 추가됩니다. 스퀘어 bioassay 판 (245mm)가 더 많은 복제 35mm 요리가 설정되었을 때 사용됩니다. 다시, 2 또는 멸균 물이 들어있는 3 열 35mm 요리를 포함합니다. </li><li> 번호판이 37 보육 세트에 전송 ° C 5 % CO2와 95 %의 습도. 증가 온도 및 겔 형성하여 콜라겐 확대해는 약 한 시간 이내 발생합니다. 문화는이 시간 동안 방해해서는 안됩니다. </li><li> 교양 세포 21일 (식민지의 크기의 차이가 명확하게 21일 후 구분할 수)에 incubated 수 있습니다. </li></ol> 4. 보충 매체를 준비하고 문화를 먹이 : N - CFCA 문화는 시간 (21 일)의 기간 동안 incubated이므로, 문화는 적절한 전체 NeuroCult와 공급한다 보충 매체는 다음과 같이 신선한 준비 : <ul><li> NeuroCult NSC 기초 중형 4.5 ML은 0.5 m로 혼합NeuroCult NSC 확산 보조 식품 후 성장 요인 L이 추가됩니다 </li><li> 10μg/mL EGF 250 μL (0.5 μg / ML EGF의 최종 농도를 제공) </li><li> 10μg/mL B - FGF (0.25μg/mL B - FGF의 최종 농도를 주다) 125 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. </li><li> 0.2 % 헤파린 125 μL은 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다. </li><li> 적절한 전체 NeuroCult의 보충 매체 (배아 또는 성인 전지)의 60 μL가 전체 NCFC 분석 문화 보육 (21 일) 동안 매 7 일마다 한 각 NCFC 분석 접시의 중앙에 추가됩니다. </li></ul> 5. N - CFC 분석 유래 식민지를 채점하고 타고난 NSCs 및 신경 전구 세포의 빈도를 계산 : <ul><li> 각 35mm 문화 요리는 2.0 mm X 2.0 mm의 격자 크기 gridded 점수 요리에 위치하고 양쪽 요리는 현미경 스테이지에 표시됩니다. </li><li> 객관 렌즈, 각각의 요리가 스캔되고 식민지가 자신의 크기에 따라 점수 아르 - 낮은 전력을 (배 2.5X)를 사용. </li><li> 식민지는 두 가지 주요 범주로 분류됩니다 : <ol><li> 이하 2mm 직경 </li><li> ≥ 2mm 직경 </li></ol></li></ul> 6. 대표 결과 : 칠일 도금 후 (그림 1) - neurosphere 분석에서와 마찬가지로, N - CFC 분석에 도금 세포 3 이내에 세포의 작은 식민지를 분아 따위에 의해 번식하고되기 시작한다. 2 주 시간에서 다양한 크기의 식민지가 구별하실 수 있습니다. 식민지의 대부분의 14 일 후에 성장을 중지하는 경향이 있지만, 일부 식민지는 크기가 증가되고 있습니다. 1mm 직경, 3) 1 - - 2mm 직경 4) ≥ 2mm 직경 미만 0.5 mm 직경, 2) 0.5 1) : 일 21에 의해 식민지는 4 가지 범주 중 하나에 분류 될 수 있습니다. 실제로, 시조가 파생된로 2mm 직경보다 작은 식민지가라고합니다 (그림 2)와 NSC는 (그림 3)과 같은 파생 식민지는 직경 ≥ 2mm가라고합니다. 도금 총 세포마다 직경 식민지 ≥ 2mm의 숫자는, 장기적인 자기 갱신과 다중 잠재적인 기능을 갖춘 실제 타고난 신경 줄기 세포의 빈도를 나타냅니다. 병렬 NSA 실험에서 7~8일 후 특정 세포 인구의 주파수를 형성 총 neurosphere은 N - CFCA 실험 21 일 후 같은 세포 인구의 주파수를 형성 전체 식민지와 유사한 것으로 추산되었습니다. N - CFCA 그러나, 각 세포는 전체 proliferative 가능성을 보여 줄 수 있도록 같은 더 허용 조건을 제공합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 2 복제 </td><td> 3 복제 </td><td> 4 복제 </td></tr><tr><td> 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 중간 </td><td> 1700 </td><td> 2550 </td><td> 3400 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 확산 보조 식품 </td><td> 330 </td><td> 495 </td><td> 660 </td></tr><tr><td> EGF (10 μg / ML) </td><td> 6.6 </td><td> 9.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> 성인용 전지 bFGF (10 μg / ML) </td><td> 3.3 </td><td> 4.95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> 성인용 세포에 대한 헤파린 솔루션 (0.2 %), </td><td> 3.3 </td><td> 4.95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1:100) </td><td> 32 </td><td> 48 </td><td> 64 </td></tr><tr><td> :에서 셀 2.2 X 10 5 교양 세포 / ML 또는 6.5 X 10 5 일차 전지 / ML </td><td> 25 </td><td> 37.5 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 콜라겐 솔루션 </td><td> 1300 </td><td> 1950 </td><td> 2600 </td></tr></tbody></table> 표 1. 완벽한 N - CFC 분석 문화의 구성 요소. <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 1. 통로 하나 E14 마우스 NSCs의 N - CFCA 문화의 대표 식민지 칠일 도금 후 그림. 식민지 다른 형태와 크기를 표시 수도 있습니다. 원본 확대, 4X <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 통과 N - CFCA 문화에서 다른 크기 21일 도금 후에도 E14 마우스 NSCs 대표 시조 파생 식민지. 그림과 같이, 식민지는 다른 형태가 있지만 모든 크기가 적은 2mm입니다. 원본 확대, 4X <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 대표 타고난 줄기 세포는 21일 도금 후 통과 한 E14 마우스 NSCs을의 N - CFCA 문화 식민지를 파생. 줄기 세포 유래 식민지는 (보고 서로 다른 형태를 표시할 수 있습니다비디오)하지만, 모두가 직경 ≥ 2mm입니다. 원본 확대, 4X

<ol><li>Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22%5BJournal%5D)">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li>
</ol>

저자 중 하나, 샤론 A. 루이스는 StemCell Technologies의 병원, 본 연구에서 사용되는 몇 가지 시약의 제작자와 제휴합니다.

neurosphere 검정 3,1,2은 성인과 배아 CNS 조직과 같은 다양한 소스로부터 신경 줄기 세포를 분리하고 확장하는 가장 일반적인 방법이지만, 정확하게 신경 전구체 세포의 혼합 인구 NSC 주파수를 측정할 수 없다 (줄기와 progenitors) neurospheres의 수와 타고난 줄기 세포 4의 사이의 숫자 1-1 관계가 아니므로. 이 제한을 해결하려면, 원본 NSA는 신경 줄기와 progenitors은 5-7 삼 주 동안 그들의 전체 확산 용량 성장할 수 있도록처럼 맞게되었습니다. 반 고체 콜라겐 매트릭스가 식민지의 한 도금 세포 및 집계의 마이 그 레이션을 방지 등 액체 NSA 달리, N - CFCA의 식민지 실제로 clonally, 파생됩니다. 이 분석과 일치의 결과를 얻으려면 우리는 좋습니다 <ol><li> 원래 세포 현탁액에서 단일 세포 현탁액을 보장합니다. 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거하는만큼 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 하나의 세포 현탁액 패스. </li><li> 얼음 또는 4 ° C 냉장고에있는 콜라겐 솔루션을 유지. 콜라겐은 온도 증가에 의해 확대해으로 세포 현탁액의 혼합에 추가할 수있는 마지막 항목입니다. </li><li> 매주 문화를 공급하는 것을 잊지 마십시오. 매 7 일마다 한 성장 인자 (들)을 포함하는 보충 미디어를 추가하면 세포가 확장 문화 기간 동안 세포 분열 따위에 의해 번식을 계속하실 수 있습니다. </li><li> 최종 셀 도금 밀도는 중 기본 또는 교양 신경 세포에서 유래 세포에 최적화된되었습니다 있도록 문화 21 일 후에 감지된 식민지의 총 개수 NCFC - A는 적어도 50의 범위 이내 - 200 식민지. 통계 분석에 대한 식민지의 충분한 숫자를 제공함과 동시에이 범위는 샘플의 직경에있는 희귀 NSC 파생 식민지&gt; 2mm의 검색이 가능합니다. 시작 셀 소스에 따라 크게 적은 (&lt;50)과 식민지의 높은 숫자가 (&gt; 250) 때로는 얻을 수 있습니다. 너무 많은 식민지가 정확 콜로니 계수의 결과로 성장 매체 구성 요소의 인구 과잉 anddepletion집니다 동안 부족 식민지는 직경이 검출 수준 아래되고있는 식민지&gt; 2mm가 발생합니다. 따라서 세포 도금 밀도 (즉, 세포 도금의 총 수를 늘리거나 감소) 따라서 조정해야합니다 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>NeuroCult NSC Basal Medium</td><td>배지</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td><td>배지 보충제</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NCFC medium</td><td>배지</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05720</td><td></td></tr><tr><td>0.05% trypsin-EDTA</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer </td><td>체</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep </td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>배양 용기</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T80 flask</td><td>배양 용기</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>시약 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>성장 인자</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>성장 인자</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>성장 인자</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>PBS로 재구성됨</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>배양 용기</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>배양 용기</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>배양 용기</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27100</td><td></td></tr><tr><td>Gridded scoring dishes</td><td>배양 용기</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

neurosphere 분석 (NSA)은 분리 확장하고 또한 신경 줄기 세포 (NSCs)의 주파수를 계산하기 위해 가장 자주 사용되는 방법 중 하나입니다. 또한,이 혈청이없는 문화 시스템은 또한 줄기 세포를 확장하고 종양과 정상 조직의 다양한 그들의 주파수를 결정하기 위해 채용되었습니다. 이것은 일대일 관계가 neurosphere 형성과 NSCs 사이에 존재하지 않는다는 것을 최근에 표시되었습니다. 이것은 NSA와 같은 현재 적용가 배아와 성인 포유류의 뇌 모두에서 분리된 신경 전구체 세포의 혼합 인구 NSCs의 빈도를 과대 평가하는 것이 좋습니다. 이 비디오는 거의 세미 솔리드 분석을 기반으로 소설 콜라겐을 보여, 신경 식민지 따라서 자신의 장기 proliferative 가능성에 따라 전구 세포에서 줄기를 차별하는 능력을 가지고 있으며, 세포 분석 (N - CFCA)를 형성하는 방법을 제공합니다 NSC 주파수를 열거할 수 있습니다. 식민지가 &lt;2mm가 progenitors에서 파생하는 동안 N - CFCA에서 직경 식민지 ≥ 2mm는 NSC의 모든 기능 기준을 만족하는 세포에서 파생됩니다. N - CFCA 절차는 기본 및 교양 성인이나 배아 마우스 CNS 세포를 포함하여 서로 다른 소스에서 준비 전지에 사용될 수 있습니다. 여기 통로에서 N - CFCA을 수행하기 위해 배아 일 14 쥐 두뇌에서 발생 한 neurospheres을 준비 세포를 사용합니다. 문화는 도금 세포들이 전체 proliferative 잠재력을 전시 있도록하고 신경 시조와 타고난 신경 줄기 세포의 빈도가 &lt;2mm 아르 콜로니의 수를 계산하여 각각 계산 확산 매체로 삼 주 동안 매일 7 일 보충함 아르 그리고 ≥ 2mm 처음 도금되었습니다 세포의 개수에 대한 언급 손님.

이 비디오 프로토콜은 신경 식민지 - 형성 세포 분석을 사용하여 신경 전구체 세포의 혼합 인구의 타고난 신경 줄기 세포를 차별하고 열거하는 방법을 보여줍니다.

뉴로스피어 분석법(neurosphere assay, NSA)은 신경줄기세포(NSCs)를 분리, 증식시키고 그 빈도를 계산하는 데 가장 빈번하게 사용되는 방법 중 하나입니다. ...

본 비디오 논문의 목적은 신경 콜로니 형성 세포 분석법(neuro colony forming cell assay)을 사용하여 신경 전구 세포 혼합 집단 내에서 진정한 신경 줄기 세포의 빈도를 정량화하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 분석법은 성체 또는 배아 CNS에서 수집한 일차 또는 배양된 신경 전구 세포에 사용할 수 있습니다. 단일 세포를 적절한 밀도로 플레이팅한 후 37 °C 인큐베이터에서 3주 동안 배양합니다.신경 전구 세포와 진정한 신경 줄기 세포의 빈도는 각각 2 mm 미만인 콜로니의 수와 2 mm 이상인 콜로니의 수를 세어 계산합니다. 혼합 신경 세포 집단 내에서 진정한 신경 줄기 세포의 빈도를 결정하기 위해 뉴로스피어 scale assay를 사용하는 것은, 뉴로스피어 형성 및 신경 줄기 세포 사이에 일대일 관계가 성립하지 않기 때문에 신경 줄기 세포의 수를 과대평가하게 됩니다. 이에 따라 본 연구실에서는 혼합 세포 분석을 위한 신경 콜로니 분석법을 개발하였습니다.이러한 제한점을 극복하기 위해, 본 분석법은 장기 증식 능력을 바탕으로 진정한 신경줄기세포와 전구세포를 쉽게 구별할 수 있습니다. 오늘 저희는 이 반고체 콜라겐 기반 분석법을 사용하여 신경줄기세포의 빈도를 산출하는 방법을 보여드리겠습니다. 세포는 E 14 마우스 배아의 해리된 신경구로부터 준비하였습니다.이제 시작하겠습니다. 이 분석에는 신경 배양 신경 줄기세포 증식, 기초 배지 보충제, 신경 콜로니 형성 세포 분석, 무혈청 배지, 콜라겐 피펫이 필요합니다. 15 mL 팰컨 튜브에 완전 신경 줄기세포 배지 1 mL를 넣습니다. 이미 준비한 세포 현탁액에서 적절한 부피를 취해 40 µm 메쉬 필터에 통과시켜 2.2 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춘 후, 플레이트에 세포를 이중으로 분주합니다.2개의 35 millimeter 배양 접시에 사이토카인이 포함되지 않은 1.7 mil의 neuro cult neural colony forming cell assay serum free medium과 30 microliter의 neuro cult neural stem cell proliferation supplement 3개를 혼합합니다. 그다음 6.6 microliter의 EGF와 32 microliters의 penicillin streptomycin을 첨가합니다.준비된 배지에 세포 현탁액 25 µL를 첨가합니다. 세포 현탁액에 차가운 콜라겐 용액 1.3 mL를 넣고, 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 부드럽게 잘 혼합합니다. 그 다음, 혼합액을 각 배양 접시의 중앙에 접시당 약 1.5 mL씩 분주하고, 혼합액이 접시 표면에 고르게 퍼지도록 둡니다.대형 페트리 접시 내의 배양 접시 옆에 놓인 개방형 35 millimeter 접시에 멸균수 3 ml를 추가합니다. 이는 배양 기간 동안 최적의 습도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 플레이트에 라벨을 붙이고 37 °C, 5% carbon dioxide, 95% humidity로 설정된 인큐베이터로 옮깁니다.콜라겐이 응고되어 신경 콜로니 형성 세포 분석 배양을 지지할 수 있도록 초기 몇 시간 동안은 배양물을 교란하지 않는 것이 중요합니다. 완전 신경 줄기세포 배지 200 µL를 취하고 10 µg/mL 농도의 EGF 10 µL를 첨가하십시오. 전체 배양 기간 동안 7일마다 각 디시의 중앙에 완전 신경 보충 배지 60 µL를 첨가하십시오.각 배양 접시를 2 mm x 2 mm 격자 크기의 격자형 판독 접시 위에 올린 다음, 저배율 대물렌즈를 사용하여 현미경 스테이지에 놓습니다. 각 접시를 스캔하고 콜로니의 크기에 따라 판독합니다. 다음은 1주 차 종료 시점의 분석 대표 결과입니다.이 시점에서는 신경 줄기세포 및 전구세포 유래 콜로니를 구분할 수 없습니다. 3주 후에는 콜로니를 두 가지 주요 범주로 분류할 수 있는데, 직경이 2mm 미만인 것은 전구세포 유래이며, 직경이 2mm 이상인 것은 줄기세포 유래입니다. 직경이 2mm 이상인 콜로니는 콜로니 내에서 진정한 신경 줄기세포의 모든 기능적 기준을 충족합니다.Cell assay plating 시 적절한 밀도로 세포를 분주하는 것은 매우 중요합니다. 콜로니 수가 너무 적으면 희귀한 신경 줄기세포 콜로니가 검출 한계 수준 이하로 유지됩니다. 반면에 콜로니 수가 너무 많으면 과밀 현상이 발생하고 배지의 주요 성분이 부족해지게 됩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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신경과학

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

췌장과 같은 progenitors은 인슐린을 표현 식민지로 차별화할 수있는 3 차원 clonogenic 분석이 설명되어 있습니다. 이 방법은 메틸 셀룰로오스, Matrigel 및 성장 요인을 포함하는 반 고체의 미디어 활용,하는 하나의 progenitors는 분아 따위에 의해 중식과...

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 세 가지 신경 계통으로 분화 할 수 세포를 참조하십시오. 여기서는 클론 조건 neurosphere 형성 및 분화를 이용하여 주어진 세포 집단에서 NSC 주파수를 결정하는 프로토콜을 기술한다.

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

이 실험 프로토콜은 lncRNA 녹다운과 콜로니 형성 분석법을 결합하여 lncRNA가 골육종 세포 증식에 미치는 영향을 정량화하는 안정적이고 비용 효율적이며 효율적인 방법을 제공합니다.

LncRNA 노크다운 골육종 세포의 증식 능력을 검출하는 콜로니 형성 분석

이 프로토콜은 환자의 골수 및 말초혈 단핵세포에서 유래한 인간 조혈 줄기세포 및 전구세포의 분화를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 검사법은 적혈구 및 골수계통 확립을 지원하는 반고체 배양지를 사용하며, 전임상 약물 특성화를 위한 재현 가능한 집락 분류를 위한 표준화된 지표를 통합합니다.

환자 유래 골수 및 말초혈 단핵세포에 적용된 군집형성 단위 분석법

배우세요 신경 콜로니 형성 세포 어세이를 사용하여 신경 전구 세포 혼합 집단에서 진정한 신경 줄기 세포의 빈도를 정량화하는 방법을 배우세요. 이 방법은 줄기 세포와 전구 세포를 구별하여 신경 발달 연구에 활용됩니다.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

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