基于生物工程，人造血管使用脉动生物反应器

该程序的总体目标是使用脉动生物反应器系统设计基于生物的血管移植物。这是通过从 PGA 网制备可生物降解的支架来实现的，细胞将在其中成排生长，并将它们组装在生物反应器室中。然后将支架与平滑肌细胞放在一起，并用带空气的盖子和进料管密封生物反应器室。

然后将生物反应器连接到流动系统，为生物反应器中的容器提供脉动流。在反应器中，细胞生长成通过免疫化学、生化和机械测试的血管。该技术的意义延伸到冠状动脉疾病的治疗，因为该技术是一种很有前途的方法，可以再生用于动脉旁路的植入式小直径血管移植物。

虽然这种方法可以提供对血管工程的见解，但它可以应用于其他器官系统，例如在循环生理力下。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎。您将需要大量练习才能完全掌握这些技能。

当我们意识到应用生理机械刺激来再生工程结构的重要性时，我们首先想到了这种方法。这种方法的视觉演示至关重要，因为生物反应器唱法过程很难学习，因为有很多步骤，只有通过详细的演示才能获得。首先，使用蒸馏水清洁 30 厘米长的 3 毫米内径硅胶管部分，并让其自然干燥。

使用剪刀为使用止血钳的每根管子剪出 1.1 厘米乘 8 厘米的 PGA 网片，因此 PGA 网用 Dexon 6.0 缝合线连接到管子上，打三个手术结，然后用止血钳单针，固定网制成 PGA 支架。首先将支架浸入一摩尔氢氧化钠中 1 到 2 分钟，然后浸入蒸馏水中 3 次，每次浸入 2 分钟。在两次洗涤之间拍干，并在第三次洗涤后让它们在罩中风干 15 分钟。

干燥后，将一厘米的涤纶袖口缝合到网眼的每一端，缝合三针。留出 2 到 3 毫米的管路重叠，不要刺穿管路。请务必留出约 15 厘米的自由缝合线，以备后用。

所有生物反应器组件和工具都事先进行了自动灭菌。在开始生物反应器培养的前一天，生物反应器必须部分组装，将生物反应器组件浸入支架中，因此将硅胶管、手术器械和长于生物反应器长度的细丝浸入 70% 乙醇浴中至少 30 分钟。使用电线将硅胶管拉过反应器的侧臂。

现在出现生物反应器，通过将涤纶袖口固定在喇叭形玻璃唇上，将 PGA 支架固定在内部。使用多余的缝合线系紧每个袖口。接下来，使用连接器，用一对生物反应器臂将支架一侧的硅胶管连接起来，并将支架另一侧的管子连接到另外两个臂上。

安装连接器后，将它们从侧臂中拉出，然后用乙醇冲洗生物反应器。让反应器每侧浸泡 10 分钟。将生物反应器放在一些培养皿上，并用组织培养物冲洗。

对水进行分级。使用移液器，请务必同时冲洗出网孔和管路。现在将无菌搅拌棒放入反应器中以备将来使用，并在通风橱中干燥设备过夜，此时打开鼓风机并关闭 UV。

不要靠在反应器上，因为这可能会导致污染在设置过程中，必须用酒精擦拭所有连接器。在制作附件之前，许多接头随后用 Paraform 加固，在应用之前必须将其浸泡在 70% 乙醇中。所以两者都要有很多。

作为预防措施，在每个生物反应器开口上放置一个无菌培养皿，以保护内部的 PGA 支架免受污染物的影响。现在通过将进样口连接到生物反应器的第三个未使用的臂来开始设置。接下来，将 IV 袋与流量系统连接。

设置 walrus 管后，将蓝色端尽可能靠近 Y 连接处系住，然后夹住管子。将红色管连接到静脉输液袋的远端。然后将白色管连接到流量系统的一侧。

将三向旋塞插入流量系统。将压力传感器管的一端连接到旋塞上，并将另一端连接到静脉输液袋的中间开口。现在要部分填充流动系统并检查是否有泄漏，请在静脉输液袋中加入 350 毫升 PBS 和 1% 真菌区。

在连接到流量系统之前或之后使用 60 毫升注射器，调整旋塞阀以控制 PBS 的流向，并挤压袋子以冲洗系统。此步骤可以在单元就座之前或之后完成。现在细胞可以放在生物反应器中。

在这个例子中，复苏悬浮 800 万个 SM 细胞，大约是 1.25 毫升培养基中的一个汇合 T 75，并将它们从 Dacron 连接处均匀滴到 PGA 支架上。添加细胞后，用酒精将生物反应器的边缘擦干净。避免悬停在反应器上。

接下来，小心组装硅胶塞盖。从高压灭菌袋中取出盖子时或在以下任何连接步骤中，请确保不要露出盖子的底部。首先，将注射口连接到外螺纹连接器处的进料管上。

其次，将 PTFE 0.20 微米过滤器连接到三个机场中的每一个。第三段，对注射口进行拍摄。将组装好的硅胶塞盖插入玻璃生物反应器中。

确保饲管不接触就位的 PGA 脚手架。然后用 Paraform 密封。现在将生物反应器连接到流动系统，并将生物反应器和流动系统置于 37 摄氏度的培养箱中。

在 25 到 30 分钟内，反应器必须侧放并每 5 分钟旋转一次。接下来，当仍在培养箱中时，使用泵通过进料管向生物反应器室中注入 400 毫升 4 至 10 种培养基。现在将播种的支架在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 6 到 7 天，无需任何脉冲泵送。

更换介质或补充维生素 C，在打开泵之前，请检查管道是否有泄漏或扭结。然后调整泵的转速，以保持负 30 到 270 毫米汞柱之间的压力范围。在整个培养过程中每天监测并保持这种压力。

更换和补充抗坏血酸应每周进行两次，同时支架通过脉动泵送生长，首先进料新鲜培养基，将注射口和 PTFE 过滤器连接到进料盖上，用于培养基更换和培养基废物处理。接下来，将饲管牢固地放入双向泵中，将一端插入生物反应器的饲喂口，另一端插入饲养盖。现在慢慢开始抽出 200 毫升培养基。

可以逐渐提高泵速。然后连接新的饲管，慢慢开始泵送 200 毫升新鲜培养基。要将抗坏血酸添加到反应器中，请使用无菌 30 毫升注射器去除 25 毫升培养基。

加入 5 毫升无菌抗坏血酸溶液，然后返回 25 毫升。培养基工程容器看起来不透明，培养 8 周后壁厚约为 250 微米。在搏动条件下，工程血管的血红蛋白、甲蛋白和伊红染色显示组织形态随时间和脉动而变化。

血管的管腔侧用 L masson 的 tri CHRO 染色表示。对于胶原蛋白，显示 4 周脉冲血管的胶原蛋白比非脉冲血管多，白色箭头指向 12 周时血管中剩余的 PGA 片段。免疫化学分析显示早期平滑肌标志物 α 肌动蛋白、中间平滑肌标志物 cal poin one 和晚期平滑肌标志物肌球蛋白重链的表达一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 7 到 8 小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住尽可能干净、清晰地按照此程序执行所有作。可以执行其他方法，例如修饰工程血管的管腔，以回答其他问题，例如在体内研究期间管腔表面修饰在工程血管维护中的重要性。在它的发展之后。

这项技术为组织工程领域，尤其是血管工程领域的研究人员在动物模型中探索治疗冠状动脉疾病的潜在方法铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何通过动态的邮政培养来实现植入式工程血管移植有一个很好的了解。不要忘记使用氢氧化钠可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如护目镜和实验服。