سبع خطوات لخلايا النجمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا النجمية الكبدية من كبد الفأر. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء أول نضح في C اثنين من كبد الفأر مع الإنزيمات الهضمية. بعد التروية ، يتم تقطيع الكبد إلى قطع صغيرة لزيادة كفاءة الهضم في المختبر ، والذي يتم إجراؤه بعد ذلك.

كخطوة أخيرة ، يتم فصل الخلايا النجمية الكبدية عن أنواع خلايا الكبد الأخرى عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة. في النهاية ، يتم الحصول على الخلايا النجمية الكبدية ويمكن تقييم نقائها عن طريق الفحص المجهري بالضوء والتألق المناعي ، ويوضح الإجراء باتريك ماير ، طالب دراسات عليا من المختبر. استعدادا ل NC ، يقوم اثنان من نضح كبد الفأر أولا بتسخين محاليل SC العازلة وإنزيم التروية في حمام مائي 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإعداد المضخة التمعجية للحصول على تدفق رقائقي يبلغ 6.5 مل في الدقيقة وموازنة أنبوب السيليكون للمضخة بمحلول SC واحد. تأكد الآن من خلال فقدان ردود الفعل أن الفأر المخدر مخدر بعمق ثم ثبت الماوس في وضع ضعيف على قاعدة مناسبة.

استخدم المقص والملقط لإجراء شق طولي في جلد البطن وفضح الصفاق. افتح الصفاق بعناية وانقل الأمعاء من تجويف البطن إلى الجانب الأيسر من لفضح الوريد البابي. أصعب جانب في هذا الإجراء هو نضح زيتو للكبد بالإنزيمات الهاضمة ، والتي سيتم إثباتها.

بعد ذلك ، من المهم استخدام مجهر استريو عند إدخال القنية ومراقبة التغيير في هياكل الكبد عن كثب أثناء التروية أثناء العمل تحت مجهر مجسم ، أدخل قنية التسريب في الوريد البابي. ابدأ نضح الكبد ب 30 مل من محلول SC واحد. افتح Vanna Cava السفلي فور بدء التدفق.

يشار إلى التنظيف الناجح للكبد بفقدان لون أنسجة الكبد بعد ذلك ، اطلع على الكبد ب 30 ملليلتر من محلول Pronase E. سوف تنتفخ فصوص الكبد وستظهر الفصيصات مميزة من خلال الكبسولة بعد وفرة بمحلول بروناز E المغطى ب 30 مل من محلول الكولاجيناز P. عند اكتمال وفرة الكولاجيناز P ، قم بحصاد الكبد من الفأر عن طريق تشريحه بعناية من الحجاب الحاجز والأعضاء المحيطة به وتخزينه في 70 مل من محلول SC Two على الجليد.

الكبد في هذه المرحلة شكله ويبدو وانا وغير متبلور. يجب أن يتم إجراء هضم كبد الفأر في ظل ظروف معقمة. في غطاء التدفق الصفيحي.

استخدم مقصا حادا لتقطيع الكبد إلى قطع من ملليمترين مكعبين في اثنين في ملليمترين مكعبين. ثم يمزج معلق 70 مل من SC اثنين وقطع الكبد مع 50 مل من محلول البروتياز E كولاجيناز P. أضف ملليلترا واحدا من الحمض النووي ، محلول واحد يهضم الكبد لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التحريك.

بعد الهضم الأنزيمي لأنسجة الكبد ، يتم فصل الخلايا النجمية عن أنواع الخلايا الكبدية الأخرى عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصافي خلية 70 ميكرومتر إلى ستة أنابيب صقر سعة 50 مليلتر واغسل الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي عازل E لمدة 10 دقائق عند 600 جي وأربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، استنشق بعناية 40 مل من المادة الطافية من كل أنبوب.

ثم أضف 150 ميكرولترا من الحمض النووي ، محلول واحد لكل أنبوب وأعد تعليق الخلايا. قم بتجميع معلقات الخلية في أربعة أنابيب فالكون سعة 50 مليلتر واغسلها بجهاز طرد مركزي G-B-S-S-P لمدة 10 دقائق عند 600 جم وأربع درجات مئوية. استنشق بعناية أكبر قدر ممكن من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وأضف 150 ميكرولترا من الحمض النووي محلول واحد لكل أنبوب.

نقوم بتعليق كريات الخلية في 10 ملليلتر من G-B-S-S-B لكل أنبوب. قم بتجميع الخلايا في أنبوبين من الصقر سعة 50 مليلتر وأضف G-B-S-S-B إلى الحجم الإجمالي البالغ 36 مليلتر لكل أنبوب. أضف 14 مل من محلول العرين إلى كل أنبوب واخلطه جيدا.

بعد ذلك ، قم بنقل 10 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي متدرج واحد سعة 12 مليلتر مما ينتج عنه إجمالي 10 أنابيب. قم بتراكب تعليق الخلية برفق مع 1.5 مل من G-B-S-S-B لكل أنبوب. الطرد المركزي التدرجات لمدة 15 دقيقة عند 1500 جي ثانية وأربع درجات مئوية دون انقطاع.

بعد ذلك ، سيتم تكوير خلايا الكبد في الجزء السفلي من الأنبوب ، بينما توجد الخلايا النجمية في الواجهة كحلقة بيضاء. باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، قم بحصاد الواجهة التي تحتوي على الخلايا النجمية بعناية ونقلها إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا. اغسل الخلايا بإضافة G-B-S-S-B والصخ المركزي لمدة 10 دقائق عند 600 جم وأربع درجات مئوية.

شفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 20 مل من DMEM مع المكملات الغذائية. بعد عد الخلايا ، انقلها إلى قوارير زراعة الأنسجة بتركيز اثنين في 10 من الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد حوالي ساعتين من تحضيرها ، يجب أن تكون الخلايا النجمية الكبدية ملتصقة ، وتغيير الوسائط لغسل الخلايا الميتة وحطام الخلايا.

إعادة الخلايا إلى الحاضنة تظهر نتائج إعداد الخلايا النجمية الكبدية من كبد الفأر باستخدام هذا البروتوكول هنا. تظهر الخلايا في اليوم الأول والثالث من الثقافة المختبرية التشكل المميز للخلايا النجمية الكبدية. إنها شكل حزاز فلكي وتعرض تخزين الحويصلات الدهنية.

في كل موقع نووي ، يمكن أيضا التحقق من نقاء الخلايا النجمية الكبدية المعزولة عن طريق التعبير عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP. تظهر هذه الصور تلطيخا مناعيا تمثيليا ل GFAP يظهر باللون الأحمر في الخلايا النجمية الكبدية ، والتي تم زراعتها لمدة ثلاثة أيام بعد عزل الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا النجمية الكبدية من الكبد العصبي للحصول على عائد كاف من الخلايا النجمية النقية.

من المهم ضمان الهضم الفعال عند تروية الكبد. أخيرا ، من الضروري تحديد الكيان المناسب للخلايا المعزولة من خلال تقييم مورفولوجيا ونمط ظاهري لخلايا دال الكبد.