عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مجموعة غنية بالكريات البيض من الخلايا المناعية الفطرية من دماغ الفئران المصابة بشكل حاد بفيروس التهاب الدماغ والنخاع العكسي أو TMEV. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول إصابة بالفئران داخل الجمجمة ب TMEV. بعد ذلك ، يتم حصاد الدماغ وتجانسه بلطف بعد 24 ساعة من الإصابة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في استخدام perca المستمر وتدرج fol المتقطع لتنقية طبقة الخلية المخصبة بالكريات البيض بشكل انتقائي. في النهاية ، يمكن تمييز النمط الظاهري للدماغ الذي يتسلل إلى مجموعة الكريات البيض المشاركة في الاستجابة المناعية للعدوى الحادة في الدماغ من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي. مرحبا ، اسمي الدكتور تشارلز هاو.

يمكن أن تساعد الطريقة التي سنعرضها اليوم في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة العصبية. على سبيل المثال ، ما هي الخلايا المناعية التي تتسلل إلى الدماغ أثناء العدوى الحادة؟ وسيكون ريغان فرنسا مظهرا للطريقة اليوم.

كوري ، كبير تقنيي الأبحاث في مختبري لاستنباط الدماغ الذي يتسلل إلى الكريات البيض. نعلق 27 إبرة قياس إلى التلقائي واحد ملليلتر هاميلتون حقنة وضبط المحقنة على الكبد 10 ميكرولتر. اسحب 10 ميكرولترات من DMEM المصاب بمرتين في 10 إلى PFU الخامس من سلالة دانيال من TMEV أو 10 ميكرولترات من DMEM المزيف في المحقنة مع إيلاء اهتمام دقيق لفقاعات الهواء.

قم بتخدير فأر عمره خمسة إلى ستة أسابيع وتأكد من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم أثناء التخدير. قم بإعداد الماوس للحقن عن طريق تحديد موقع الإحداثيات المناسبة بسرعة في منطقة القشرة الأمامية على جزء الجمجمة ، وفراء الفأر مع نقطة الإبرة على طول كل من AEs حسب الاقتضاء للحقن لجعل الحقن يوجه الإبرة بشكل عمودي على الجمجمة والضغط على الإبرة من خلال غطاء العظام إلى عمق تقريبي ثلاثة ملليمترات. للتعبير عن DMEM المصاب بالفيروسات أو DMEM المصاب بالوسام في الدماغ ، اضغط على زر حقنة هاميلتون لأسفل وانتظر ثانيتين حتى تدخل الوسائط إلى الدماغ قبل الانسحاب.

قم بإزالة الإبرة بعناية وضع الماوس في قفص نظيف وجاف. ستستيقظ الفئران من التخدير بسرعة وتستأنف وظيفتها الطبيعية في غضون دقيقة واحدة ، بعد 24 ساعة من العدوى الفيروسية أو الزائفة داخل الجمجمة. وقبل عزل الدماغ الذي يتسلل إلى الكريات البيض ، املأ أنبوب الطرد المركزي Oakridge القاع المستدير ب 10 ملليلتر من RPMI 1649 مل لكل مكالمة ومليلتر واحد من 10 XPBS وقم بتخزين الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.

أحضر حزمة مكالمات FI plus إلى درجة حرارة الغرفة واملأ أنبوبا مخروطيا سعة 15 ملليلترا بخمسة ملليلتر من RPMI وضعه على ICE في هذا الوقت أيضا. بعد التضحية بالحيوان عن طريق تعديل الجرعة الزائدة من الفلور ، قم بإزالة الدماغ بسرعة ووضعه في الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلترا. تحتوي على خمسة ملليلتر من RPMI ثم تنقل الدماغ ومحلول RPMI إلى ماركة Pyrex زجاجية سعة سبعة ملليلتر ، وطحنة أنسجة 10 جرامدة وتجانس الدماغ بلطف مع 10 إلى 15 ضربة.

بعد ذلك، قم بإدخال خمسة ملليلتر إضافي من RPMI في الخالط وقم بسحب المحلول لأعلى ولأسفل مرتين. انقل ما يقرب من 10 ملليلتر من تجانس الدماغ إلى أنبوب الطرد المركزي ذو التلال السفلية المستديرة المعدة مسبقا واقلب الأنبوب برفق مرتين إلى ثلاث مرات للخلط. الآن قم بتدوير الدماغ متجانس عند 7 ، 800 جي ثانية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي دوار بزاوية ثابتة.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة بقايا المايلين التي طفت إلى أعلى التدرج. تطفو طبقة الكريات البيض فوق حبيبات خلايا الدم الحمراء. صفي طبقة الكريات البيض من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ارفع المحلول إلى حجم 50 مل. باستخدام PMI الخاص بنا ، قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية المخفف في جهاز طرد مركزي سريري عند 600 Gs لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط المادة الطافية وجمع حبيبات الخلية.

أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس وإضافة تعليق الخلية إلى أنبوب فاكس دائري بسعة خمسة ملليلتر. قم بوضع التعليق بعناية مع ملليلتر واحد من الغرفة. حزمة استدعاء درجة الحرارة بالإضافة إلى تدوير أنابيب الفاكس عند 800 Gs في جهاز الطرد المركزي السريري لمدة 25 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع، قم بإزالة الطبقة البيضاء الرقيقة في الواجهة باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد وانقل الطبقة إلى أنبوب فاكس جديد سعة خمسة ملليلتر. اغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس. الآن قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي السريري لتكسير الخلايا.

ثم استنشق الاسم الفائق وجمع بيليه الخلية. أعد تعليق حبيبات الكريات البيض في المخزن المؤقت للسد ، واستمر في وضع الثلج. ثم عد الخلايا.

بعد عزل وعد الدماغ الذي يتسلل إلى الكريات البيض. ضع الخلايا في صفيحة سفلية على شكل حرف V استعدادا للتنميط المناعي لقياس التدفق الخلوي. ثم قم بتدوير الخلايا في جهاز طرد مركزي سريري.

أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة بتركيز واحد إلى 200 ، واحتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة أخرى على الجليد هذه المرة في الظلام. ثم قم بتدوير الخلايا الملطخة في جهاز الطرد المركزي السريري ثم استنشاق المادة الطافية.

أضف 200 ميكرولتر من مخزن الفاكس المؤقت إلى الحبيبات وقم بتمرير الماصة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات. ثم اغسل الخلايا في جهاز الطرد المركزي مرتين أخريين بنفس الطريقة بعد الغسيل النهائي ، الخلايا بتركيز نهائي قدره 2٪ بارا فورمالديهايد ونقل الخلايا الملطخة إلى أنابيب الفاكس. أخيرا ، أرسل الخلايا الثابتة لقياس التدفق الخلوي وقم بتحليل الملفات في وضع عدم الاتصال باستخدام برنامج تحليل الفاكس.

تم عزل كريات البيض في الفئران من الدماغ عن طريق الكثافة التفاضلية ، والطرد المركزي للأنسجة المتجانسة المحضرة من في 24 ساعة بعد العدوى داخل الجمجمة. كما رأينا في هاتين المخططين النقطيين ، تم العثور على الخلايا الوحيدة الالتهابية الإيجابية LY ستة CG الإيجابية F أربعة 80 CD 11 B إيجابية بشكل حصري تقريبا في CD 45 ، وهو عدد كبير من السكان بما يتفق مع تسلل هذه الخلايا من المحيط. في المقابل ، تم العثور على LY six CG سالب F أربعة 80 ، ومنخفضة CD 11 B الضامة الموجبة بشكل حصري تقريبا في CD 45 ، ولوحين منخفضين يسار و CD 45 مجموعات لوحة يمين متطرفة سلبية متوافقة مع النمط الظاهري المقيم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكريات البيض من دماغ المصابة بشكل حاد.