קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

למעלה מ-60 מיליון בני אדם נדבקו ב-HIV, הנגיף הגורם לאיידס. HIV איידס הוא משבר בריאות עולמי, ולמרות שמאמצי מחקר אינטנסיביים העניקו להם באופן דרמטי את חייהם של אנשים נגועים, חיסון אמיתי נותר חמקמק. מוקד עיקרי של מחקר חיסוני HIV הוא גליקופרוטאין המעטפת, שבו HIV משתמש כדי להיכנס לתאי מטרה.

בסרטון הזה אנו מדגימים כיצד אנו משיגים מבנים של החלבון החשוב הזה באמצעות טכניקת דימות שנקראת טומוגרפיה קריו-אלקטרונים. החל מ-HIV מטוהר, אנו מראים שלבים בהכנת דגימות קפואות, שלבים בהקלטת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרוניות מהדגימות הקפואות הללו ושלבים בהמרת תמונות אלה למודלים מבניים שיכולים להיות שימושיים לתכנון חיסון איידס HIV. היבט ייחודי של מה שאנו מציגים בסרטון זה הוא שהעבודה תודגם על ידי חברי המעבדה שלה המשתרעים על פני טווח רחב של גילאים, החל מתלמידי חטיבת ביניים ותיכון, דרך סטודנטים ברמת מכללה ותואר שני ועד לעמיתי פוסט-דוקטורט ומדענים בכירים.

הכנת דגימות וירוסים מזוגגות המתאימות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית מתבצעת על ידי פיזור תרחיף מימי של וירוסים על פני חורים קטנים בסרט פחמן הנתמך על ידי רשת נחושת, ולאחר מכן הקפאה מהירה של הנגיפים. מטרת שלב זה היא להכין דגימה קפואה של נגיפים שלמים שנלכדו במצב קרוב ליליד. כדי להתחיל, הרשתות ממוקמות בתוך יחידת פריקת זוהר.

מכשיר זה מנקה את הרשתות על ידי חשיפתן לגז מיונן. כעת, כשהרשתות מוכנות לשימוש, מכינים תרחיף של נגיפים מעורבבים עם חלקיקי זהב קטנים. חלקיקים אלה חיוניים לאיסוף ועיבוד נתונים.

לאחר מכן, טיפת תרחיף וירוסים מונחת על רשת ניקוי הפלזמה הטרייה. לאחר מכן הרשת נטענת ברובוט, שמכתים אותה בנייר פילטר, ומצמצם את הטיפה לסרט דק של נוזל. לאחר מכן הדגימה צוללת לתוך אתאן נוזלי, שמקפיא במהירות את הנגיפים בקצב העולה על 100,000 קלווין לשנייה.

לאחר מכן, הרשת הקפואה מועברת לקופסת אחסון להובלה למיקרוסקופ. זה חוזר על עצמו עד להקפאת מספר הרשתות הרצוי. כעת, כשרשתות הדגימות של הנגיף מוכנות, השלב הבא הוא לטעון אותן למיקרוסקופ.

לצורך הדמיה, ניתן לעשות זאת באופן ידני או בסיוע רובוטי. כאשר רשתות הדגימה נטענות ידנית, המשתמש יושב בתחנה מיוחדת שבה ניתן לתפעל את הדגימות תחת חנקן נוזלי, הדגימות מונחות בתא קירור חנקן נייד שנאטם, מפונה ולאחר מכן מחובר למיקרוסקופ. מיקרוסקופים חדשים יותר מסוגלים לטעינת דגימות אוטומטית יותר.

כאן במיקרוסקופ Titan Cryos, דגימות קפואות מועברות למיקרוסקופ על ידי המשתמש ולאחר מכן נטענות באופן רובוטי עם רשתות הדגימה הטעונות במיקרוסקופ. כל רשת יכולה להיבדק על ידי המשתמש לפני תחילת ההדמיה. פרמטרי המיקרוסקופ מוגדרים עבור כל אזור ברשת הדגימה שיש לו תכונות מעניינות.

במקרה זה, התכונות הן נגיפי HIV. כאשר כל אזור חדש מוגדר, מחשב המיקרוסקופ מאחסן את פרמטרי ההדמיה הספציפיים לאזור. כאשר המשתמש הגדיר את כל המיקומים המעניינים, המחשב מבקר מחדש כל עמדה באופן אוטומטי ואוסף מערך נתונים.

כל מערך נתונים נאסף על ידי הטיית רשת הדגימה ביחס לאלומת האלקטרונים, תוך הבטחה שהקרן תישאר ממוקדת באותה נקודה ברשת. איסוף נתונים במיקרוסקופ אלקטרונים דרש באופן מסורתי מהמשתמשים לשבת ליד המיקרוסקופ ולקיים אינטראקציה פיזית עם הציוד. סגנון זה של אינטראקציה במיקרוסקופ מוצג כאן במהלך ביקור של הנשיא אובמה במפעל מודיעין.

ההתקדמות האחרונה בממשקי מחשב מיקרוסקופ מאפשרת כעת למשתמשים לנטר ולהתאים את איסוף הנתונים בזמן אמת ממחשב מרוחק במעבדה או במקום אחר. על מנת לדמיין את צורות המעטפת, יש לחשב ממוצע של גליקופרוטאין את המידע ממאות תמונות בודדות כדי להגביר את האות. זהו תהליך אינטנסיבי מבחינה חישובית, שמתבצע כאן באמצעות אשכול מחשבים שנקרא Bio Wolf.

ממוקם ב-NIH, פותחו שיטות עוצמתיות לחילוץ נפחים בודדים ולממוצע המידע באמצעות אלגוריתמים שיכולים לעבוד ברמות הרעש הגבוהות. מהותי לסוג זה של נתונים, מפות הצפיפות המתקבלות הן מנגיפים מקומיים והן מווירוסים מורכבים עד מולקולות חשובות מבחינה ביולוגית מספקות מסד נתונים עשיר של מידע על הביולוגיה המבנית של HIV. מפות הצפיפות מתעוררות לחיים בפירוט מולקולרי כאשר הנתונים משולבים עם מידע מקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן של יחידות המשנה הבודדות המרכיבות את ספייק הגליקופרוטאין של המעטפת.

נתונים שיוצאים מהטומו הללו יכולים להיות צפופים ומאתגרים מאוד interpret. 3D ניתן להשתמש בתוכנה לתעשיית הבידור כדי להמחיש את המודלים התלת מימדיים על ידי הוספת צבעים, מרקמים ותאורה, מה שמקל על ניתוחם. תוכנת הדמיה נפוצה כוללת Mirror 3D Studio Max ו-Maya.

זה עתה הדגמנו נהלים שלב אחר שלב כיצד ניתן להשיג מודלים מולקולריים למבנה המעטפת. גליקופרוטאין, החל מ- HIV מטוהר. באמצעות שיטה זו, קבענו גם מבנים לגליקופרוטאין המעטפת בקומפלקס עם מגוון מולקולות שיכולות לקשור ולנצל את הנגיף.

כאן אנו מראים דוגמה למבנה הגליקופרוטאין המעטפת בקומפלקס עם נוגדן הנקרא B12. ההבנה מדוע מולקולות מסוימות יכולות להיקשר ולנצל את הנגיף בעוד שאחרות לא חשובה מאוד לתכנון חיסון רציונלי. קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים מעטפת מ-HIV או מנגיפים אחרים, כגון שפעת ואבולה, היא המפתח להבנת הכניסה והניצול של הנגיף.

כפי שראיתם, טומוגרפיה קריו-אלקטרונית מתגלה כעת ככלי רב עוצמה להשגת מטרה זו.