Name: 포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 배우세요 포유류 상피 세포에 박테리아가 부착하는 정량 분석 방법을. 세포 배양, 세척, 용해 후 CFU 계산으로 병원성 균주의 부착 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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저자의 연구실에서 작업은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회, 건강 연구의 캐나다 연구소, 그리고 캐나다 연구 의자 프로그램에서 교부금에 의해 지원됩니다. JL은 퐁 드 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡에서 지원금을 통한 Groupe D&#39; 에투드 데스 Protéines Membranaires (GEPROM)에서 화목에 의해 지원됩니다.

1. 예선 : 박테리아 변종과 상피 세포. 세포 및 박테리아의 조작은 층류 후드 아래 무균 수행됩니다. <ol><li> 갓 E.을 분리 콜리 변종 2787, 2787Δ 아이다 및 C600 글리세롤 주식의 Lysogeny 스프 (LB) 한천 플레이트 (1 % tryptone, 0.5 %의 나트륨 염화물, 0.5 % 효모 추출물, 1.5 %의 한천)에 37에서 성장 ° C. 검정의 다양성을 최소화하기 위해, 그것은 갓 도금 변종을 항상을 사용하고 ° C 봉인 페트리 접시에서만 몇 주 최대 4에서 긴장을 유지 좋습니다. </li><li> 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)에 문화 형 간염 - 2 세포 (ATCC CCL - 23) 10 % 열 inactivated 소 혈청 (열 불활 성화가 ° C 30 분 56 수행)와 보충. 일상 문화 중에 우리는 또한 10 U / ML 페니실린 및 10 μg / ML 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 37 형 간염 - 2 세포를 성장 ° CO 2 5 %를 포함하는 분위기 세포 배양기에서 C. 75cm 2 flasks 그들이 합류에 도달 subcultured 때마다에서 재배하는 세포를 유지하기 위해 표준 세포 배양 절차를 사용하십시오. 우리는 그들이 30-40 구절에 도달할 때까지 우리의 교양 세포를 사용하고 그들을 폐기. </li><li> 75cm이 플라스크에있는 C 형 간염 - 2 세포가 거의 합류에 도달하기 때문에 준수 분석을위한 준비가되면 분석을 준비합니다. </li></ol> 2. DAY 1 : inoculum와 상피 세포를 준비 <ol><li> 8g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 0.2 g / L KH 2 PO 4, 0.21 g / L 나 2 HPO 4 : : 7H 따뜻한 Dulbecco의 인산이 (DPBS 호수 버퍼와 한번 술병에있는 C 형 간염 - 2 세포를 씻어 2 O) </li><li> 신선한 따뜻한 전체 매체를 추가하기 전에 5 분 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 세포는 0.05 % 트립신과 함께 incubated 있습니다. 신선한 매체가 추가되면 전지와 위아래로 pipetting하여 resuspended 있습니다. </li><li> 5 분 2,000 RPM의 세포 현탁액을 원심 분리기와 DPBS에서 알약을 resuspend 다시 원심 분리기. </li><li> 10 %의 혈청과 보충하지만, 2x10 5 셀 / ML의 농도에서 더 항생제를 포함하지 신선한 매체 세포를 Resuspend. </li><li> 시드 그 중 한명은 24 잘 접시의 중앙에 중복 웰스 (각 변형에 대해 하나) 세​​ 가지 세트의 세포 현탁액의 밀리리터와 세포 문화 인큐베이터에서 하룻밤 접시를 품어. 참고 : 혈청이 완전히 decomplemented해야하고 항생제가이 단계 이후 생략하는 것이 중요합니다. 이렇게하지 ​​않으면 감염 박테리아를 죽일 수 있습니다. </li><li> LB의 국물 5 ML (1 % tryptone, 0.5 %의 나트륨 염화물, 0.5 % 효모 추출물)의 각 세균의 변형 중 하나를 격리 콜로니 (2787, 2787Δ 아이다 및 C600)을 접종하고 37 야간 성장 ° 활발한 잡고 C (180 RPM ). </li></ol> 3. DAY 2 : 세포의 감염 <ol><li> 그들이 최소한 90 % 합류하고 오염되지 않은 것을 확인할 거꾸로 현미경 형 간염 - 2 세포를 검사합니다. </li><li> 각 잘하는 따뜻한 DPBS하고있는 세포를 씻어, 10 %의 혈청과 보충 신선한 중간 1 ML을 추가하지만 항생제를 포함하지 않습니다. 세포없이 3 웰스 신선한 매체도를 추가합니다. 이것은 각 변형에 대한 inoculum에서 세균의 총 수를 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> 세균성 문화 600 NM (OD 0.600 nm의)에서 광학 밀도를 측정합니다. C 형 간염 - 2 세포를 포함하는 중복 웰스 중 하나를 설정 하나 잘 포함하지 않는 세포를 각 세균성 문화의 나누어지는를 추가합니다. 보통, 우리는 10 6 콜로니 형성 단위 (cfu)에 해당하는 숙박 문화의 볼륨을 사용합니다. (세포 박테리아)이 5시 1분의 감염의 다중성을 (뫄) 나타냅니다. 우리가 직접 우리의 야간 문화를 사용하지만, (예 : cytotoxins과 같은 예를 들어) 야간 문화에있는 분비 분자의 해로운 효과를 피하기 위해 박테리아를 원심과 DPBS에서 그들을 resuspend하기 위해 때로는 좋습니다 참고 : 뫄는 100:1과 1시 10분 사이 다를 수 있습니다. 높은 뫄 높은 다양성과 배경을 산출하고 박테리아가 접시의 플라스틱에 집중하는 경향이 있습니다. 뫄 로우어도 높은 다양성을 산출. 뫄이 선택되면, 그것은 일관되게이 뫄 유지하는 필수적입니다. </li><li> 37 3 시간 동안 세포 배양기 문화에 감염된 세포를 품어 ° C 5 % CO 2. 참고 : 직접 세포 접촉에있는 모든 박테리아를 가지고하기 위해 잠시 저속 (1-2 분 예 : 1000 XG)에서 번호판을 원심 수도 있습니다. 이것은 감염을 동기화의 추가 혜택을 가지고 있으며, 짧은 배양 시간 (적게 15-30로 분)을 수 있도록합니다. </li><li> 감염된 세포에서 매체를 제거하고 따뜻한 DPBS와 세포에게 3 회 씻는다. 이 단계에서 자기편 박테리아는 일반적으로 표준 현미경으로 볼 수 우리는 정기적으로이 검사를 수행할 수 있습니다. </li><li> 세포를 lyse하고 준수 BAC를 분리teria는 트리톤 X - 100 각 1 %의 100 μl를 추가할 잘 세포를 포함하는. 기타 세제는 (예 : 예를 들어 사포닌 등) 사용할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 분에 대한 세포를 부화 후 LB 매체 900 μl를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 pipetting 상하 반복하여 suspensions을 균질. inoculum를 포함하는 세포가없는 우물은 비슷하게 부드럽게 균질하고 있습니다. 참고 : 일부 박테리아는 우리가 0.05 % 트립신과 부화하여 상피 세포를 분리되는 경우, 세제에 너무 민감한 것 - ​​EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 20 분에 대해 37 ° C. 준수 박테리아와 함께 세포도 피펫 팁있는 우물에서 까진 수 있습니다. </li><li> LB 한천 3 dilutions (보통 1:1,000, 1:10,000과 1:100,000 dilutions)에서 LB의 국물과 플레이트 100 μl를 사용 준수 박테리아 및 inoculum의 suspensions 일련 10 배 dilutions을 준비하고 37 밤새 품어 ° C . </li></ol> 4. 3 일 : cfu의 계산 및 데이터 프레 젠 테이션. <ol><li> 접시에 식민지를 카운트하고 dilutions의 각 시리즈를 평균하여 준수 박테리아와 inoculum의 cfu의 개수를 계산합니다. 10-300 식민지 사이에서만 플레이트는 계산해야합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 다음 표는 준수 박테리아와 다른 일을 수행할 세 실험에서 inoculum의 계수 cfu의 전형적인 결과를 보여줍니다 : <img src="/files/ftp_upload/2783/2783table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 그림 1A와 같이 결과는 직접으로 cfu을 준수보고 수 있습니다. inoculum 크기 때문에 성장 속도의 차이 또는 pipetting 오류의 변종마다 다를 수 있기 때문에 준수 박테리아의 비율로 결​​과를보고하는 것이 좋습니다. 그림 1B와 같이 준수 세균의 비율은, inoculum의 cfu의 숫자로 준수 박테리아의 cfu의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. 그림 1B의 모든 컬럼을 비교하기 위해 반복 측정 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트를 수행함으로써, 우리는 상당한 아이다 2787과 2787Δ 차이 (P는 &lt;0.05),뿐만 아니라 2787과 C600 사이에있다는 것을 볼 수 없지만, 더 큰 차이가 있습니다 2787Δ 아이다과 C600 사이. <img src="/files/ftp_upload/2783/2783fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 준수 세균 cfu (A) 또는 준수 박테리아의 비율 (B)로 검색 결과의 표현 관찰 준수의 비율은 종종 실험에 매우 의존 셋업 (그리고, 낮은 정도로, 실험자에). 특히 중요한 뫄하고 세척의 수가 너무 비율은 문자 그대로 해석해서는 안됩니다. inoculum의 박테리아는 때때로 세포와 우물에서 세균의 실제 총수와 비교하여 inoculum의 크기를 왜곡, 세포의 존재에있는 박테리아보다 훨씬 빠르게 커질 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해, 그것은 어느 것을 권장합니다 : C 형 간염 - 2 세포가 추가 우물에 씨앗을 품고 및 감염 : (I)는 inoculum을 결정하는 세포와 우물을 사용합니다. 대신 폐기의 분석의 마지막에서 뜨는 및 세탁 10 % 트리톤 100 μl는 X는 - 100은 잘에 추가됩니다. 세포가 lyse하고 준수 및 비 준수 세균을 포함하고있는 lysate는 부드럽게 반복 상하 pipetting하여 균질이며. 또는 (ii) 분석의 끝에 감염된 세포의 supernatants를 수집뿐만 아니라 supernatants에서 DPBS의 세척 및 그 풀링 supernatants에 cfu의 수를 결정합니다. 이것은 비 준수 박테리아의 cfu의 개수를 반환합니다. 준수 세균의 비율은 다음 준수 및 비 준수 박테리아의 cfu의 숫자의 추가에 의해 준수 박테리아의 cfu의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. 분석의 견고을 설명하기 위해, 우리는 최근에 설립 tracheal 돼지 세포 라인, NPTr 8 세포와 incubated S4074과 함께 수행한 분석, Actinobacillus pleuropneumoniae 7 접착제 돼지의의 병원성 변형,이 프로토콜을 비교할 수 있습니다. 이외에도 세균과 세포의 성장에 필요한 매체의 차이에서, 유일한 차이점은 감염에 사용되는 박테리아가 고정 상 야간 문화 기하 급수적으로 증가하는 문화, 그리고 아니라는 점이다. A.로 pleuropneumoniae 그것은 달리 독소의 분비는 세포 죽음과 바이어스 결과가 발생할 것이며, 뫄 10시 1분의를 존중하고 감염 3 시간을 초과하지하는 것도 매우 중요합니다. A.의 또한이 스트레인 그것이 합류 세포를 사용하여 세포가 꺼져 sloughing 아니라는 것을 시각적으로 확인하는 것이 중요하므로 pleuropneumoniae는 쉽게 플라스틱을 준수합니다.

<ol><li>Kline, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesins+in+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesins in host-microbe interactions.</a> Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).</li>
<li>Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+microbiology+emerging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular microbiology emerging.</a> Science. 271, 315-315 (1996).</li>
<li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).</li>
<li>Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPizarro-Cerda%2C+J+%22Molecular+Cellular+Microbiology%22">Molecular Cellular Microbiology</a>. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).</li>
<li>Srivastava, A., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSrivastava%2C+A+%22Molecular+Cellular+Microbiology%22">Molecular Cellular Microbiology</a>. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).</li>
<li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+an+adhesin+%28AIDA-I%29+involved+in+diffuse+adherence+of+enteropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).</li>
<li>Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+is+not+essential+for+multiple+functions+of+the+Escherichia+coli+autotransporter+adhesin+involved+in+diffuse+adherence+%28AIDA-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I).</a> J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).</li>
<li>Jacques, M., Paradis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesin-receptor+interactions+in+Pasteurellaceae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae.</a> FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).</li>
<li>Auger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae+with+porcine+lung+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells.</a> Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).</li>
<li>Jacques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipo-oligosaccharides+and+lipopolysaccharides+in+bacterial+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence.</a> Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).</li>
<li>Nataro, J. P., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diarrheagenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diarrheagenic Escherichia coli.</a> Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).</li>
<li>Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+clinical+isolates+of+diarrhoeogenic+Escherichia+coli%3A+diffusely+adhering+E.+coli+strains+with+multiple+adhesive+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors.</a> Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 (gentamicin 보호 분석 3을 사용 예) 침략을 공부하기 위해 수정할 수있는 표준 준수 세균 분석을 설명합니다. 콜로니 형성 단위의 계산은 Giemsa의 얼룩 같은 현미경 표준 시각화 기법에 의존 접근과 비교하여, 부량 수 있습니다. 후자는 접착력의 질적 전망을 제공하지만 접착력의 다양한 패턴을 차별하고 mechanistical 통찰력에게 9 줄 수 있기 때문에 종종 유용하게 보완합니다. 예를 들어 Giemsa이 2787의 10 7 cfu의 inoculum 수행할 얼룩은 그림 2에 표시된 및 Diffusely 준수 대장균 10 특징 전체 세포 표면에 확산 접착력을 나타냅니다. 이 프로토콜의 양적 측면에도 불구하고, 그것은 결과가 일반적으로 변수는 것을 강조해야합니다. 긍정적인 컨트롤보다 접착력의 100 배 낮은 수준 - 부정적인 컨트롤은 일반적으로 10 ~ 필요...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 높은 포도당 DMEM </td><td> GIBCO - Invitrogen </td><td> 12430-054 </td></tr><tr><td> DDPBS </td><td> GIBCO - Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> 보빈 성장 세럼 </td><td> Hyclone </td><td> SH3054 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> GIBCO - Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> 24 웰 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3337 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP151 - 100 </td></tr></tbody></table>

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

감염을 원인 박테리아들은 숙주를 식민지해야합니다. 세균성 병원균은 세포 하나를 호스트하기 위해 첨부 파일을 홍보할 수 다양한 분자 또는 구조를 표현한다. 이러한 adhesins는 숙주 세포 표면 수용체 또는 박테리아와 호스트 사이의 다리 역할을 수용성 단백질과 상호 작용에 의존하고 있습니다. 접착력 전에 침략 및 / 또는 독소의 분비에 중요한 첫 번째 단계이며, 따라서 그것은 세균 pathogenesis에서 공부하는 주요 행사입니다. 또한, 준수 박테리아는 종종 정교하게 미세 조정 세포 반응, &#39;세포 미생물학&#39;2의 분야에 출산을 가지고있는 연구를 유도. 세균성 호스트 세포의 접착과 침략에 ​​대한 강력한 assays 따라서 세균 pathogenesis 연구의 핵심 역할을하고 오랫동안 많은 선구자 실험실 3,4에서 사용되었습니다. 이러한 assays 이제 세균 pathogenesis 작업 대부분의 실험실에서 연습하고 있습니다. 여기, 우리는 특정 adhesin의 기여를 설명하는 표준 준수 분석을 설명합니다. 우리는 대장균 스트레인 2787 5, 확산 준수 (아이다)에 관련된 autotransporter Adhesin을 표현하는 인간 병원성 변형을 사용합니다. 컨트롤로서, 우리는 아이다 유전자, 2787Δ 아이다 (F. 버타이오메와 M. Mourez, 발표되지 않은), 그리고 E. 상업 실험실 부담을 부족한 돌연변이 변형을 사용하여 대장균, C600 (뉴 잉글랜드 Biolabs). 박테리아는 일반적으로 사용되는 C 형 간염 - 2 인간 상피 세포주에서 세포을 준수하기 위해 남아 있습니다. 이 분석은 덜 광범위 6 이전에 설명되었습니다.

이 프로토콜은 교양 세포에 준수 아르 단위를 형성하는 박테리아 식민지의 숫자를 계산에 구성된 간단한 세균 유착 분석이다. 분석은 강력한이며, adhesin 독립 공부하고, 다수의 유사 콘텐츠는 세균 pathogenesis 작업을 대부분의 실험실에 사용됩니다.

감염을 일으키기 위해 박테리아는 반드시 숙주에 정착해야 합니다. 박테리아 병원균은 숙주로의 부착을 촉진할 수 있는 다양한 분자나 구조를 발현합니다...

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 포유류 세포에 대한 박테리아의 부착 정도를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아를 배양된 세포와 일정 시간 동안 함께 배양함으로써 수행됩니다. 그 다음, 결합하지 않은 박테리아를 세척하여 제거합니다.그 다음, 부착된 박테리아를 회수하기 위해 세포를 용해합니다. 마지막으로, 회수된 박테리아를 페트리 접시에 도말합니다. 최종적으로 페트리 접시 위의 콜로니 형성 단위(colony forming units) 수를 측정함으로써 포유류 세포에 부착된 박테리아의 수를 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.이 금속은 이 분야의 병원성 박테리아에 있어 이온 메커니즘 및 숙주 세포 침입과 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움을 주며, 병원성 박테리아의 다양성에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 일반적으로 연구자들은 절차의 세척 및 회수 단계에서 일관성이 부족하여 이 새로운 방법을 사용하는 데 어려움을 겪습니다. 본 연구에 사용될 박테리아를 준비하려면, 여기에 표시된 것처럼 Mucoid broth 격자 위에 *Escherichia coli* 병원성 균주와 같은 글리세롤 스톡에서 박테리아를 신선하게 도말하고 37 °C에서 배양하십시오. 도말된 플레이트는 4 °C에서 밀봉하여 2주 이상 보관하지 마십시오.어세이에 사용된 포유류 Hep Two 세포는 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 취급하며, 10% 열불활화 소태아혈청(heat inactivated bovine serum), 10 units/mL penicillin, 10 µg/mL streptomycin이 함유된 고농도 포도당 DMEM 배지에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 유지합니다. 세포가 거의 합류(confluence) 상태에 도달하면 통상적으로 어세이 준비가 완료된 것이며, 따뜻한 PBS(phosphate buffered saline)로 한 번 세척하여 세포를 분리합니다.0.05% trypsin EDTA로 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 신선하고 따뜻한 완전 배지를 첨가하고 세포 현탁액을 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 이어서 세포 펠릿을 DPBS에 재현탁하고 다시 원심분리합니다.항생제가 없는 10% serum이 보충된 신선한 배지에 세포를 재현탁하여 2 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다. 24-well 플레이트 중앙의 중복 웰(duplicate wells)에 각 세포주당 1 mL의 세포 현탁

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Stones, DH, et al. 박테리아-숙주 상호 작용을 특성화하기 위한 생체모방 재료. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 경쟁 조건에서 숙주 상피 세포에 대한 박테리아 부착을 정량화하기 위해 박테리아 유사체 비드를 사용하는 방법을 보여줍니다. 세포를 처리하고, 용해하고, 콜로니 형성 단위를 측정하기 위해 연속 희석액을 도금하는 단계에 대해 간략하게 설명합니다.

생체모방 비드를 사용한 박테리아-숙주 세포 상호 작용 평가

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

이 비디오에서는 헤모필루스 인플루엔자가 숙주 상피 세포에 순응하는 과정에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다.

숙주 상피 세포에 대한 박테리아 부착에서 Vitronectin의 역할을 연구하기 위한 분석

이 비디오에서는 형광 현미경을 사용하여 암세포가 호중구 세포외 트랩(NET)에 부착되는 것을 감지하는 분석을 시연합니다. 테스트 웰에서는 NET에 부착된 형광 표지된 암세포의 수가 눈에 띄게 증가한 반면, DNase로 처리된 웰은 NET에 대한 암세포 부착력이 감소한 것으로 나타났습니다.

암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

이 보고서는 특성화 세균성 외부 막 단백질 및 인간 보완 레 귤 레이 터 vitronectin 사이 상호 작용에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 바인딩 반응 어떤 세균성 종에 vitronectin의 생물 학적 기능을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.

호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

배우세요 포유류 상피 세포에 박테리아가 부착하는 정량 분석 방법을. 세포 배양, 세척, 용해 후 CFU 계산으로 병원성 균주의 부착 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

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