Name: ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: למדו שיטת מדידת הידבקות חיידקים לתאי יונקים בתרבית. הפרוטוקול כולל חיבור חיידקים לתאים, שטיפה, פירוק התאים וספירת יחידות יוצרות מושבות. שיטה זו מסייעת בחקר מנגנוני פתוגנזה חיידקית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה במעבדות של המחברים נתמך על ידי תרומות של למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה, המכונים לחקר קנדה הבריאות, את תוכנית המחקר קנדה כיסאות. JL נתמך על ידי מענק של Groupe d&#39;אטיוד דה Protéines Membranaires (GEPROM) באמצעות מימון מן דה Fonds משוכלל ונדיר en סנטה du קוויבק.

1. ראשוני: זני חיידקים ותאי אפיתל. מניפולציות של תאים וחיידקים הם מתבצע בסביבה נקייה מחיידקים, מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי לבודד את ה coli זנים 2787, 2787Δ אאידה, ו C600 ממניות גליצרול על מרק Lysogeny (LB) צלחות אגר (1 tryptone%, 0.5% נתרן כלורי, תמצית שמרים 0.5%, אגר 1.5%) ו לגדול ב 37 ° C. כדי למזער משונות assay, מומלץ תמיד להשתמש זנים מצופה טרי לשמור על זנים ב 4 ° C חתום על צלחות פטרי בלבד לכל היותר כמה שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HEP-2 תאים (ATCC CCL-23) של גלוקוז השתנה Dulbecco גבוה של הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% מומת חום בסרום שור (איון חום מתבצע ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). במהלך התרבות שגרתי אנחנו גם להוסיף 10 U / ml פניצילין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הפ-2 תאים על 37 מעלות צלזיוס בתא האינקובטור עם אווירה המכיל 5% CO 2. השתמש תקן תרבות נהלים התא כדי לשמור על התאים, אשר גדל ב 75 ס"מ 2 צלוחיות זמן subcultured כל שהם מגיעים למפגש. אנו משתמשים בתאים בתרבית שלנו עד שהם מגיעים 30-40 קטעים, ואז להשליך אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן assay כאשר HEP-2 תאים בקבוקון 75 ס"מ 2 הם כמעט הגיעו למפגש, ולכן מוכנים assay דבקות. </li></ol> 2. יום 1: הכנת inoculum ותאי אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את-2 HEP תאים הבקבוק פעם עם פוספט Dulbecco חם שנאגרו מלוחים (DPBS: 8 גרם / L NaCl, 0.2 גר '/ L KCl, 0.2 גר' / L KH 2 PO 4, 0.21 גר '/ L Na 2 HPO 4: 7H 2 O) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מודגרת עם טריפסין 0.05% - EDTA 5 דקות לפני הוספת טרי בינוני מלא חמה. לאחר בינוני טריים הוא הוסיף, התאים resuspended ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא בסל"ד 2000 דקות 5 ו resuspend את כדורי ב DPBS ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בינוני טריים בתוספת סרום המכיל 10% אך ללא אנטיביוטיקה, בריכוז של 5 2x10 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע אחד למיליליטר של השעיה תא שלושה סטים של בארות כפולות (אחד עבור כל זן) במרכז צלחת 24 באר ו דגירה את הצלחת לילה תרבות התא חממה. הערה: חשוב כי הסרום להיות decomplemented ביסודיות כי אנטיביוטיקה מושמטים אחרי השלב הזה. הימנעות מלעשות זאת עלולה להרוג את החיידקים הדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן one מושבה מבודדת של כל זן חיידקי (2787, 2787Δ אאידה C600) ב 5 מ"ל של מרק LB (1 tryptone%, 0.5% נתרן כלורי, תמצית שמרים 0.5%) ו לגדול בין לילה בשעה 37 ° C עם רעד נמרץ (180 סל"ד ). </li></ol> 3. יום 2: זיהום של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את HEP-2 תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא כי הם לפחות 90% ומחוברות ולא מזוהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את התאים עם DPBS חם, זה היטב, להוסיף 1 מ"ל של מדיום טריים בתוספת סרום המכיל 10% אך ללא אנטיביוטיקה. כמו כן להוסיף בינוני טרי שלוש בארות ללא תאים. זה ישמש כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקים inoculum עבור כל זן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את צפיפות אופטית ב 600 nm (OD 0.600 ננומטר) של התרבויות חיידקי. הוסף aliquot של כל תרבות חיידקי להגדיר אחד בארות כפול המכיל הפ-2 תאים אחד גם לא המכיל תאים. בדרך כלל אנו משתמשים בנפח של תרבות לילה המקביל ל 10 6 יחידות המושבה להרכיב (CFU). זה מייצג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 05:01 (חיידקים: תאים). למרות שאנו ישירות להשתמש תרבויות הלילה שלנו, לפעמים רצוי בצנטריפוגה חיידקים resuspend אותם DPBS כדי למנוע השפעות מזיקות של מולקולות מופרש בהווה בתרבויות לילה (כגון cytotoxins, למשל) הערה: משרד הפנים יכול להשתנות בין 100:1 ו - 1:10. משרד הפנים גבוהה בתשואות השתנות גבוה ורקע וחיידקים נוטים לדבוק פלסטיק הצלחת. תחתון משרד הפנים גם תשואות שונות גבוהה. ברגע משרד הפנים נבחר, הכרחי להיות עקביים ולהמשיך זה למשרד הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים נגועים של תרבית תאים בחממה במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: ניתן גם צנטריפוגות בקצרה את הצלחת במהירות נמוכה (למשל 1000 XG 1-2 דקות), כדי להביא את כל החיידקים ישירות במגע עם התאים. זה כולל את היתרונות נוסף של סנכרון את הזיהום, ומאפשר פעמים הדגירה קצר (קצת כמו 15-30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום מן התאים הנגועים ולשטוף את התאים 3 פעמים עם DPBS חם. בשלב זה, חיידקים חסיד בדרך כלל ניתן לראות במיקרוסקופ רגיל אנו מבצעים בדיקה זו באופן שגרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי lyse התאים ולנתק את BAC דבקteria, להוסיף 100 μl של 1% Triton X-100 זה טוב המכיל את התאים. דטרגנטים אחרים יכולים לשמש (כגון saponin למשל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 900 ​​μl של מדיום LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות homogenize השעיות חוזרות ונשנות על ידי מעלה מטה pipetting. בארות ללא התאים המכילים את inoculum הם דומה הומוגני בעדינות. הערה: חיידקים מסוימים עשויים להיות רגישים יותר מדי חומר ניקוי, במקרה שיש לנו לנתק את לתאי האפיתל על ידי הדגירה עם טריפסין 0.05% - EDTA במשך 20 דקות על 37 ° C. תאים יחד עם חיידקים דבק יכול להיות גם מגורד מבארות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרתי של פי 10 דילולים של המתלים של חיידקים דבק ו inoculum באמצעות מרק LB ו - 100 μl צלחת מ 3 דילולים (בדרך כלל דילולים 1:1,000, 1:10,000 ו - 1:100,000) על אגר LB ו דגירה לילה בשעה 37 ° C . </li></ol> 4. יום 3: ספירת CFU והצגת נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות על הצלחות ועל לחשב את מספר CFU של חיידקים דבק של inoculum על ידי חישוב ממוצע כל סדרה של דילולים. רק צלחות עם מושבות בין 10-300 צריכה להיות מנה. </li></ol> 5. נציג התוצאות: הטבלה הבאה מציגה תוצאות אופייני CFU ספירה של חיידקים דבק ו inoculum מ - 3 ניסויים שבוצעו בימים שונים: <img src="/files/ftp_upload/2783/2783table1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> התוצאות ניתן לדווח ישירות דבק כמו CFU, כפי שמוצג באיור 1 א. מאז בגדלים inoculum יכול להשתנות בין זנים בגלל הבדלים בשיעורי הצמיחה או טעויות pipetting, היא לעתים קרובות רצוי לדווח על תוצאות כאחוז של חיידקים דבק. האחוז של חיידקים דבק יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר CFU של חיידקים דבקו במספר CFU של inoculum, כפי שמוצג באיור 1 ב. על ידי ביצוע צעד ANOVA חוזרות Bonferroni שלאחר בדיקות להשוות את כל העמודות של 1B איור, אנו יכולים לראות כי ישנם הבדלים משמעותיים (p &lt;0.05) בין 2787 ו 2787Δ אאידה, וכן בין 2787 ו - C600, אבל אין הבדל משמעותי בין 2787Δ אאידה C600. <img src="/files/ftp_upload/2783/2783fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ייצוג התוצאות כפי CFU של חיידקים דבק (א) או שיעור של חיידקים דבק (ב) אחוז ההיענות נצפו לעתים קרובות תלויים מאוד הניסוי הגדרת (ובמידה פחותה, על הניסוי). חשוב במיוחד הם הפנים ומספר שוטף, כך אחוז אין לפרש פשוטו כמשמעו. חיידקים inoculum יכולים לפעמים לצמוח הרבה יותר מהר מאשר את החיידקים בנוכחות של תאים, שתשבש את גודל inoculum בהשוואה למספר הכולל האמיתי של חיידקים בארות עם תאים. כדי להקל על בעיה זו, מומלץ גם: (i) להשתמש בבארות עם תאים כדי לקבוע את inoculum: HEP-2 תאים זרע היטב נוספים נגועים. בסוף assay, במקום להשליך supernatant ועל כביסה, 100 μl של טריטון 10% X-100 הוא הוסיף היטב. התאים יהיה lyse ואת lysate המכיל חיידקים דבק ולא דבק הוא הומוגני בעדינות על ידי חזרה מעלה ומטה pipetting;. או (ii) לאסוף את supernatants של תאים נגועים בסוף assay, כמו גם מן supernatants DPBS שוטף ולקבוע את מספר CFU באותם supernatants ונקווה. זו תניב את מספר CFU של חיידקים שאינם דבק. האחוז של חיידקים דבק אז יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר CFU של חיידקים דבק על ידי תוספת של מספר CFU של חיידקים דבק ולא דבק. כדי להמחיש את חוסנו של assay, אנחנו יכולים להשוות את זה עם פרוטוקול assay שבוצעה עם S4074, חזירי דבק פתוגניים זן של Actinobacillus pleuropneumoniae 7, מודגרות עם תאים קו הקימה לאחרונה תא קנה הנשימה חזרזיר, NPTr 8. מלבד ההבדלים בתקשורת נדרש צמיחה של חיידקים לתאים, ההבדל היחיד הוא כי חיידקים המשמשים זיהום הם מתרבות גדל באופן אקספוננציאלי, ולא מן התרבות נייח שלבים לילה. עם א pleuropneumoniae זה גם חשוב מאוד לכבד את הפנים של 10:01 ולא יעלה על 3 שעות של זיהום, אחרת את הפרשת רעלים יגרום למוות התא הטיה בתוצאות. בנוסף, זן זה של A. pleuropneumoniae יכול בקלות לדבוק פלסטיק ולכן חשוב להשתמש בתאי ומחוברות ולוודא ראייה כי התאים אינם ומשילה מעליה.

<ol><li>Kline, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesins+in+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesins in host-microbe interactions.</a> Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).</li>
<li>Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+microbiology+emerging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular microbiology emerging.</a> Science. 271, 315-315 (1996).</li>
<li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).</li>
<li>Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPizarro-Cerda%2C+J+%22Molecular+Cellular+Microbiology%22">Molecular Cellular Microbiology</a>. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).</li>
<li>Srivastava, A., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSrivastava%2C+A+%22Molecular+Cellular+Microbiology%22">Molecular Cellular Microbiology</a>. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).</li>
<li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+an+adhesin+%28AIDA-I%29+involved+in+diffuse+adherence+of+enteropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).</li>
<li>Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+is+not+essential+for+multiple+functions+of+the+Escherichia+coli+autotransporter+adhesin+involved+in+diffuse+adherence+%28AIDA-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I).</a> J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).</li>
<li>Jacques, M., Paradis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesin-receptor+interactions+in+Pasteurellaceae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae.</a> FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).</li>
<li>Auger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae+with+porcine+lung+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells.</a> Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).</li>
<li>Jacques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipo-oligosaccharides+and+lipopolysaccharides+in+bacterial+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence.</a> Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).</li>
<li>Nataro, J. P., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diarrheagenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diarrheagenic Escherichia coli.</a> Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).</li>
<li>Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+clinical+isolates+of+diarrhoeogenic+Escherichia+coli%3A+diffusely+adhering+E.+coli+strains+with+multiple+adhesive+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors.</a> Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מתאר assay תקן היצמדות חיידקית כי ניתן לשנות ללמוד הפלישה (למשל באמצעות גנטמיצין assay הגנה 3). ספירת יחידות המושבה להרכיב מאפשרת כימות, על ידי השוואה עם גישות להסתמך על טכניקות להדמיה תקן תחת מיקרוסקופ, כגון מכתים Giemsa. זה האחרון רק נותן תצוגה איכותית של הידבקות אך לעיתים קרובות משלימים שימושי שכן הוא יכול להבחין בדפוסים שונים של הדבקה ולתת תובנות mechanistical 9. למשל Giemsa הכתם הופיע עם inoculum של 10 7 CFU של 2787 מוצג באיור 2 ו ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> גלוקוז גבוהה DMEM </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 12430-054 </td></tr><tr><td> DDPBS </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> צמיחה שור סרום </td><td> Hyclone </td><td> SH3054 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> 24 צלחות טוב </td><td> קורנינג </td><td> 3337 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP151-100 </td></tr></tbody></table>

ב assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

כדי לגרום לזיהומים, חיידקים חייב ליישב המארח שלהם. חיידקים פתוגנים לבטא מולקולות שונות או מבנים מסוגל לקדם מצורף לארח תאים 1. Adhesins אלה מסתמכים על אינטראקציות עם התא המארח הקולטנים או חלבונים מסיסים מתנהג כמו גשר בין חיידקים המארח. הידבקות היא צעד ראשון קריטי לפני הפלישה ו / או הפרשת רעלים, ולכן הוא אירוע מפתח להיחקר בפתוגנזה חיידקי. יתר על כן, לעתים קרובות חיידקים דבק לגרום להפליא מכויל התגובות הסלולר, המחקרים אשר הולידו בתחום 2 &quot;הסלולר מיקרוביולוגיה&quot;. מבחני עמידות עבור הידבקות חיידקים על תאים המארח הפלישה שלהם ולכן ממלאים תפקידים מרכזיים מחקרים בפתוגנזה חיידקים כבר מזמן משמשים רבים חלוץ במעבדות 3,4. מבחני אלה התאמן היום על ידי רוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי. כאן אנו מתארים assay דבקות תקן הממחישות את התרומה של adhesin ספציפיים. אנו משתמשים זן coli Escherichia 2787 5, זן פתוגניים האדם לבטא את autotransporter Adhesin מעורב דבקות מפוזר (AIDA). כמו שליטה, אנו משתמשים זן מוטנטי חסר את הגן אאידה, 2787Δ אאידה (פ Berthiaume ומ Mourez, לא פורסם), וכן מעבדה זן מסחרי של E. coli, C600 (ניו אינגלנד Biolabs). חיידקים נשארים לדבוק תאים מן השורה נפוץ HEP-2 תאים אנושיים אפיתל. Assay זו תוארה בהרחבה לפני פחות 6.

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

כדי לגרום לזיהומים, חיידקים חייבים להתנחל במארחם. פתוגנים חיידקיים מבטאים מולקולות או מבנים שונים המסוגלים לקדם היצמדות למארח...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את ההיצמדות של חיידקים לתאי יונקים בתרבית. דבר זה מושג תחילה על ידי דגירה של חיידקים עם תאים בתרבית למשך פרק זמן מסוים. לאחר מכן, החיידקים שאינם קשורים נשטפים.לאחר מכן, התאים עוברים ליזיס כדי לשחרר את החיידקים ההיצמדים. לבסוף, החיידקים ששוחללו נזרעים בצחנות פטרי. באופן זה, ניתן לקבל תוצאות המראות את מספר החיידקים שהיצמדו לתאי יונקים באמצעות ספירת מספר יחידות יוצרות מושבות (CFUs) בצחנות הפטרי.מתכת זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של חיידקים פתוגניים, כגון מנגנוני יונים ופלישה לתאי מאחס, ובכך לספק תובנות חדשות על השונות של חיידקים פתוגניים. באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו יתקלו בקשיים עקב חוסר עקביות בשלב השטיפה וההשגה של הפרוצדורה. כדי להכין את החיידקים המשמשים למחקר זה, זרעו חיידקים טריים ממאגרי גליצרין, כגון זני *Escherichia coli* פתוגניים כפי שמוצג כאן, על צלחות עם מצע מזיאת מיו-ג'ר (Mueller-Hinton broth) והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שמרו את הצלחותים אטומים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה שאינה עולה על שבועיים.תאי ה-Hep-2 של יונקים המשמשים במדידה מטופלים תחת מנדף זרימה למינרית ונשמרים ב-DMEM עם גלוקוז גבוה, 10% סרום בקר שעבר אינאקטיבציה בחום, 10 units per milliliter פניצילין ו-10 micrograms per milliliter סטריפטומייצ

in-vitro-assay-of-bacterial-adhesion-onto-mammalian-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Stones, D. H., et al. חומרים ביומימטיים לאפיון אינטראקציות חיידקים-מארחים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש בחרוזים בקטריומימטיים כדי לכמת הידבקות חיידקים לתאי אפיתל מארחים בתנאים תחרותיים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בטיפול בתאים, ליזה שלהם וציפוי דילולים סדרתיים למדידת יחידות יוצרות מושבה.

הערכת אינטראקציות בין חיידקים לתאים מארחים באמצעות חרוזים ביומימטיים

מקור: קלטאיוד ארויו, מ., ואחרים. הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקים סינתטי בממשק המארח-מיקרוב המעי במבחנה. J. Vis. Exp. (2018).סרטון זה מדגים מודל של מארח-מיקרוב במעי במבחנה לחקר חיוניות חיידקים. קו-קולטורה של תאי Caco-2 ו-HT29-MTX מדוגרת עם חיידקים שעברו טיפול מוקדם בתנאי עיכול מדומים. שלמות מחסום האפיתל מוערכת באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית, וחלקים מהתווך, הריר הממס, הליזאט התא ושאריות התא נאספים לניתוח במורד הזרם.

מודל המעי במבחנה להערכת הידבקות ואינטרנליזציה של חיידקים

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה לחקר תפקידו של ויטרונקטין בהיצמדות המופילוס אינפלואנזה לתאי האפיתל של המאכסן.

מחקר לחקר תפקידו של ויטרונקטין בהיצמדות חיידקים לתאי אפיתל מארחים

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות הידבקות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). בבארות הבדיקה ניכרת עלייה ניכרת במספר התאים הסרטניים המסומנים באופן פלואורסצנטי הנצמדים ל-NETs, בעוד שבבארות שטופלו ב-DNase נרשמה היצמדות מופחתת של תאים סרטניים ל-NETs.

בדיקת הידבקות חוץ גופית לאיתור היצמדות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

במבחנה יכולים לשמש מבחני דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של Streptococcus pneumoniae לאפיתל monolayers תא ולחקור התערבויות פוטנציאליות כגון השימוש בפרוביוטיקה לעיכוב קולוניזציה ריאות.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

כדי לחקור את האינטראקציה של חיידקים עם כלי הדם תחת לחץ גזירה, מתוארים תא זרימה ומודל מיקרוסקופיה תוך-חיונית מזנטרית in vivo המאפשרים לנתח את גורמי החיידקים והמארח התורמים להידבקות כלי הדם.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

הדו ח מתאר פרוטוקולים עבור אפיון אינטראקציות בין חלבונים חיידקי הממברנה החיצונית vitronectin מווסת את המשלים אנושי. הפרוטוקולים ניתן ללמוד את איגוד תגובות והתפקוד הביולוגי של vitronectin של כל מין חיידקית.

מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

למדו שיטת מדידת הידבקות חיידקים לתאי יונקים בתרבית. הפרוטוקול כולל חיבור חיידקים לתאים, שטיפה, פירוק התאים וספירת יחידות יוצרות מושבות. שיטה זו מסייעת בחקר מנגנוני פתוגנזה חיידקית.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

גלה סרטונים נוספים