Name: Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: 학습하세요 마우스 눈에서 유리체와 망막을 내장 적출하는 방법을. 원심분리와 단백질 분석을 통해 조직을 분리하고 프로테오믹스 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

기금은 시력과 실명을 방지하기 위해 연구 전투에 의해 제공되었다.

1. 앞쪽에 세그먼트 해부. <ol><li> limbus에 후부 Scleral 조직은 0.22 forcep과 세계 (눈 공) 안정화는 함께 파악합니다. </li><li> microsurgical 블레이드는 limbus에서 limbus로 각막의 선형 절개를하는 데 사용됩니다. </li><li> 0.12 콜리 브리 forcep는 다음 절개에서 각막을 파악하는 데 사용됩니다. </li><li> 앞쪽에 챔버 유체는 다음 샌드위치 - 셀 수술 창으로 흡수됩니다. </li></ol> 2. 렌즈 내장 적출. <ol><li> 각막 쥐고 0.12 콜리 브리 forcep는 세계를 안정화하는 데 사용됩니다. </li><li> 멋진 곡선 바늘 홀더 (또는 곡선 드레싱 포셉) 지구의 후부 측면 방향으로 렌즈 뒤에 삽입됩니다. 바늘 홀더가 부분적으로 폐쇄하고, 앞으로 가져온 것입니다. 압력이 안구 벽은 그대로 둔 상태에서 각막 절개를 통해 앞으로 렌즈를 못살게 굴지 공막엔의 외부 표면에 포셉를 사용하여 적용됩니다. 유리체는 반투명 젤로 표시하고 렌즈에 부분적으로 자기편이다. </li><li> 렌즈 - 유리의 조직​​은 다음 PBS에 용해 테아제 억제제 칵테일 (로체) 20 microliters을 포함하는 필터링 원심 분리 튜브에 배치됩니다. </li></ol> 3. 망막의 내장 적출. <ol><li> 각막 절개를 쥐고 0.12 콜리 브리의 집게와 함께 지구를 안정화하기 위해 계속합니다. </li><li> 멋진 곡선 바늘 홀더 (또는 곡선 드레싱 포셉) 시신경 근처 가능한 세계에까지 후부로 배치됩니다. 바늘 홀더가 부분적으로 폐쇄하고, 앞으로 가져온 것입니다. 압력은 각막 절개를 통해 앞으로 망막들을 못살게 굴지 공막엔의 외부 표면에 포셉를 사용하여 적용됩니다. 유리체가 망막에 자기편 반투명 젤로 나타납니다. 망막은 노란색, vascularized 조직으로 시각이다. 색소 조직의 스트립은 집게로 멀리 벗겨 수 있습니다. </li><li> 망막 - 유리체 조직은 다음 렌즈 - 유리 조직을 포함하는 필터링 원심 튜브에 배치됩니다. </li></ol> 4. 원심 분리를 필터링. <ol><li> 여과 원심 분리기 튜브는 benchtop의 원심 분리기에 배치됩니다. 12분에 대한 14,000 X G에서 스핀. </li><li> 유리체있는 하부 챔버에서 eluant을 대기음. 망막은 상부 챔버에 남아 있습니다. 이 샘플은 단백질 연구를 위해 이용하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 유리 샘플은 SDS - PAGE (그림 2)에 의해 분석되었다. 샘플은 또한 효소 활동 분석 (그림 3)에 사용되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마우스 눈 다이어그램. 인간과 마우스 눈 교차 단면 개략도는 큰 렌즈로 인해 마우스 눈을 상대 작은 유리 볼륨을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 한 차원 SDS - PAGE 마우스 유리체 및 망막의. 단백질 마우스 유리의 프로필, 13.6 MG / ML (레인 1), 그리고 망막, 11.35 MG / ML (레인 2). 젤 전기 영동은 플라밍고 형광 겔 얼룩 물들일, 45 분 150 KV에서 공연하고 VersaDoc 이미징 시스템 (BioRad, 헤라클레스, CA)를 사용하여 시각되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 마우스와 인간의 유리체에서 초과 산화물의 dismutase (소드) 효소 활동. 총 소드 활동의 측정 (소드 활동 colorimetric aasay 키트, # AB65354, Abcam, 병원, 캠브리지, MA) 유리와 DBA와 흰둥이 생쥐에서 내장 적출에 의해 수집된 망막에서 수행되었다. 이것은 인간의 유리 코어 및 상대적인 활동을 결정하기 위해 사후 인간 기증자 눈을에서 수집한 인간의 망막에있는 소드 활동에 비해했다. Undiluted 유리체 코어 샘플은 수동으로 23 게이지 바늘, 11, 망막은 눈 꽃과 거리 RPE / 맥락막 복잡한에서 조직을 절단하여 수집되었습니다을 사용 aspirated했다. 분석은 소드 isoforms 구분하지는 않지만 그것이 유일한 세포 이소형이기 때문에, 유리체 소드 활동, SOD3을 반영 가능성이 12 망막 소드 활동이 세 소드 isoforms을 반영 가능성이 있습니다. 세포내 SOD1, mitochondrial SOD2, 그리고 세포 SOD3가. 12이 소드 분석을 포함하여 고도로 민감한 효소 assays, 들어, 단백질의 교차 오염의 가능성이 가능하고 추가 연구를 필요로합니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &amp, Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Ophthalmol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye%3A+Anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. 161-195 (2002).</li>
<li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li>
<li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+Stickler%27s+syndrome%3A+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+%28pro%29collagen+gene+%28Col2a1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li>
<li>Marneros, A. G. &amp, Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII%2Fendostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li>
<li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li>
<li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

동물 실험은 안과 및 비전 연구에 동물의 사용에 대한 안과 정책에 연구 및 비전 협회에 따라 수행되었다.

유전자 변형 생쥐는 망막과 vitreoretinal 질병을 조사하는 중요한 모델입니다. 6-10는 마우스 유리 본체 그러나, 마우스 눈 속에있는 대형 렌즈로 인한 인간의 유리에 비해 눈 크게 작은 비율로 구성되어 있습니다. 5이 있습니다 그것은 어려운 마우스 유리를 분리하고 정화합니다. 이러한 proliferative 당뇨성 망막 병증의, 나이 관련 황반 변성, uveitis, 그리고 망막 분리와 같은 질병 중 유리체와 관련된 단백질의 변화를 이해하는 것은 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다 어떤 사람들이 진행하여. 효소 및 proteomic 분석을위한 단백질 수율을 극대화하면서이 시각 실험 프로토콜, 마우스 유리기구를 구하고 정화하기위한 수단을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 15 °, BD 비버 Microsurgical 블레이드 </td><td> 백톤 디킨슨 - </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 산도 7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 미세 Castroviejo Suturing의 포셉 </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 콜리 브리 포셉 </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 132분의 2 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon 원심 필터 Ultracel YM - 100 YM - 50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> 소드 활동 Colorimetric 분석 키트 </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> 샌드위치 - 셀 외과 스피어스 </td><td> 메드 트로닉 </td><td> 0,008,680 </td><td></td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로체 </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> 플라밍고 형광 젤은 얼룩 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

마우스 망막은 상속 망막 질환의 중요한 유전 모델로 등장했습니다 동안 마우스 유리는 탐험으로 남아 있습니다. 유리체는 intraocular뿐만 아니라 extraocular 단백질이 질병 중에 축적 망막을 overlying 매우 수성 세포외 기질이다. 유리체와 망막 사이의 1-3 비정상적인 상호 작용 이러한 망막 분리, proliferative 당뇨병의 망막 병증, uveitis, 그리고 proliferative vitreoretinopathy과 같은 여러 가지 질병을 기초 1. , 마우스 렌즈는 안구의 약 75 % 점유 이후 4 상대 마우스 유리 볼륨은 인간의 유리 (그림 1)보다 훨씬 작습니다. 5이 어려운 마우스 유리의 생화 학적 연구를 하였다. 이 동영상이 문서에서 우리는 유전자 변형 마우스 모델의 사용이 더 명확하게 vitreoretinal 질병의 개발이 세포외 기질의 역할을 정의할 수 망막에서 마우스 유리를 해부하다하고 분리하는 기술을 제시한다.

해부 기술은 유리체, 망막, 그리고 마우스 눈에서 렌즈, 원심 분리에 의해 분리하고, 단백질 as​​says과 특성화의 내장 적출을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

마우스 망막이 유전성 망막 질환의 중요한 유전적 모델로 부상했지만, 마우스의 유리체는 여전히 탐구 대상으로 남아 있습니다. 유리체는 ...

사람의 눈과 마찬가지로 생쥐의 눈에는 유리체라고 불리는 액체 상태의 세포외 기질이 채워져 있습니다. 이 공간의 대부분은 수정체로 채워져 있습니다. 유리체와 망막을 분리하기 위해서는 먼저 전안부를 절제하고, 포셉으로 눈을 고정한 뒤, 매우 날카로운 칼날을 사용하여 각막을 가로질러 한 번 절개해야 합니다.무딘 칼날은 각막을 찢을 수 있으며 여러 번의 절삭이 필요할 수 있습니다. 전방의 액체를 흡수하기 위해 WEX 세포 스펀지를 사용합니다. 화살표는 포셉으로 수정체와 유리체를 짜내어 포셉을 부분적으로 닫고 앞으로 당겨낼 위치를 나타냅니다.수정체는 투명한 구체처럼 보이며, 그 뒤로 유리체 겔이 이어집니다. 이 예시에서는 유리체가 수정체 뒷면에 부착된 상태로 남아 있습니다. 망막을 분리하기 위해 망막 핀셋을 시신경 근처의 더 뒤쪽으로 배치한 다음, 가볍게 쥐어 앞쪽으로 당깁니다. 망막은 노란색의 젤라틴성 물질처럼 보입니다.어떤 경우에는 망막, 유리체 및 수정체가 하나의 조직으로 함께 추출됩니다. 다음 단계는 필터 원심분리 장치를 사용하여 이 세 가지 조직을 분리하고 분리하는 것입니다. 필터 조각을 에핑도르프 튜브 상단에 넣고 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline)를 추가합니다.각 조직을 분리함에 따라, 필터가 포함된 상단 웰에 배치합니다. 렌즈는 왼쪽 상단 모서리에, 망막 유리체는 오른쪽 하단 위치에 둡니다. 튜브를 마이크로 원심분리기에 넣고 14,000 Gs에서 12분 동안 원심분리합니다.유리체는 에펜도르프 튜브 바닥으로 가라앉고, 망막은 상부에 남게 됩니다. 핀셋을 사용하여 수정체를 망막으로부터 분리한 다음, 상부 웰에서 망막을 격리합니다. 이 모든 조직은 에펜도르프 튜브에 넣은 후 단백질체 분석을 위해 처리할 수 있습니다.

evisceration-of-mouse-vitreous-and-retina-for-proteomic-analyses

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 사후의 눈에 인간의 유리 신체의 다양한 반투명 구조를 차별하고 해부를위한 효과적인 기법을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 인적 유리 바디 요소의 해부

트립신 다이제스트 망막 혈관을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 원고는 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 기술을 최적화하고 비 혈관 조직을 제거 키 변경 등 세부 방법을 설명합니다.

트립신 다이제스트 프로토콜 마우스 모델의 망막 혈관을 분석하는

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병/당뇨병성 망막병증 관련 모욕으로 인한 사망에 대한 망막 혈관의 복원력을 모니터링하기 위해 보호 분석법이 개발되었습니다.

마우스의 당뇨병 관련 사망으로부터 망막 혈관 보호를 감지하기 위한 분석

이 프로토콜은 망막 광수용체 말단의 구조적 특징에 초점을 맞춰 부피 전자 현미경을 위해 망막 샘플을 준비하기 위한 자세한 단계를 설명합니다.

부피 전자 현미경을 위한 망막 시료 준비

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

학습하세요 마우스 눈에서 유리체와 망막을 내장 적출하는 방법을. 원심분리와 단백질 분석을 통해 조직을 분리하고 프로테오믹스 연구에 활용할 수 있습니다.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

더 많은 동영상 탐색