מבנה של HIV-1 הרכבות capsid על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים cryo-ו איטרטיבי לשיקום שטח נדל סליל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה להשגת מבנה תלת מימדי של מולקולות מורכבות הלי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריו. הפרוטוקול מתחיל בהכנת דגימת קריו EM בשיטת דילול מהיר וספיגה אחורית כדי להפחית באופן זמני את ריכוז המלח בעת הכנת רשת ה-EM המיובשת הקפואה. תהליך זה מבטיח יציבות חלבון תוך הפחתת רעשי רקע ושיפור יחס האות לרעש במהלך איסוף נתוני המינון הנמוך של cryo EM לאחר איסוף הנתונים.

אינדקס סלילי של דפוסי עקיפה הושלם. לאחר מכן מבוצע עיבוד תמונה, ואחריו שחזור תלת מימד בחלל האמיתי, וכתוצאה מכך מפת הצפיפות הסופית של HIV קפסיד אחד או צינור ca. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שישנן מספר נקודות קריטיות לאיסוף וניתוח נתונים מיטביים.

לדוגמה, במקרה של HIV מכלולים צינוריים של קפסיד אחד הנוצרים רק בתמיסת מקור טוחנת אחת המפחיתים במהירות את ריכוז המלח מבלי להשפיע על המבנה. זה קריטי להשיג תמונות קריו EM באיכות גבוהה. בהינתן תמונת צינור, קשה מאוד ללמוד מה לעשות כדי לאנדקס שפופרת קריטית ואיזו תוכנה יכולה להיחשב לביצוע שחזור תלת מימד.

סרטון זה מספק גישה מפורטת ופשוטה להשגת שחזור תלת מימדי של אובייקטים פיזיים ויכול לשמש כהתייחסות לניסוי שלך. אני אדגים את ההליך עם ד"ר פוג'ה. שנינו פוסט-דוקטורנטים ממעבדת ד"ר כדי להכין את מכלולי חלבון הקפסיד האחד של HIV לקריו הם מתחילים בזוהר, ופורקים את צד הפחמן של 200 רשתות נחושת רשת מתחת ל-25 מיליאמפר למשך 25 שניות.

השתמש בנבולייזר כדי להביא את הלחות ל 80% בתא הסביבתי, שהוא בוכנה כבידה ידנית תוצרת בית. בינתיים, אתאן נוזלי קריר בבוכנה של בוט מבחנה עם חנקן נוזלי הרכיב את עושה הקפאת הצלילה על בוכנת הכבידה הידנית. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להדק את הצבתות סגורות על קצה הרשת.

מרחו 2.5 מיקרוליטר של תמיסת חלבון מורכבת מראש על צד הפחמן של הרשת. לאחר מכן העמיסו את המלקחיים על הבוכנה כשצד הפחמן של הרשת פונה הצידה. הוסף שלושה מיקרוליטרים של מאגר דילול מלח נמוך לחלק האחורי של הרשת.

מחק מיד את הרשת עם פיסת נייר פילטר באותו צד. שמור את כל המשטח האחורי של הרשת במגע הדוק עם נייר הסינון למשך כשש שניות. לאחר הסרת נייר המסנן, צללו מיד את הרשת לאתאן נוזלי.

לבסוף, הסר את המלקחיים מהבוכנה והעביר במהירות את הרשת לקופסת אחסון רשת. התחל מיקרוסקופ אלקטרונים קריו על ידי טעינת הרשת המיובשת הקפואה למיקרוסקופ FEI Polar G שני אלקטרונים. פועל ב-200 קילו-וולט ומצויד במצלמת גטין 4K על 4K CCD.

במצב חיפוש במינון נמוך, הוסף הגדלה של כ-200x. סנן את כל הרשת עבור אזורים עם קרח מתאים. שמור את המיקומים של אזורים אלה בקובץ שלב.

אחזר את המיקומים שנשמרו וסנן עוד יותר את האזורים הללו. הוסף הגדלה של פי 3, 900 במצב חיפוש במינון נמוך. בחר את האזורים עם קרח שכבה דקה אחידה לאיסוף נתונים, המאופיינים בכך שהם מכילים צינורות ארוכים התלויים מעל חור.

שמור את כל האזורים בקובץ שלב שני. עבור למצב חשיפה. הוסף הגדלה של 59, 000 x והכניס צמצם אובייקטיבי של 100 מיקרומטר.

לאחר מכן התאם את הסטיגמה האובייקטיבית ואת עוצמת האלומה למינון של כ-15 אלקטרונים לאנגסטרום בריבוע לכל חשיפה. חזור למצב חיפוש במינון נמוך ועבור למצב שמור. זהה ומרכז צינור טוב.

באמצעות מתג מצלמת CCD למצב מיקוד, כוונן את המיקוד והגדר ערך טשטוש בדרך כלל בין 0.5 ל-2.5 מיקרומטר. לאחר מכן עבור למצב החשיפה והגדר זמן חשיפה של 0.3 עד 0.5 שניות למינון של 15 אלקטרונים לאנגסטרום בריבוע. אסוף את התמונות במצלמת צלחת, ואפשר לסרטים להתיישב במשך 10 שניות לפני צילום החשיפה.

לאחר איסוף התמונות, עבור למיקום השמור הבא וחזור על תהליך זה כדי לאסוף תמונות נוספות. פתח את הסרטים במלוא עוצמתם D 19 למשך 12 דקות. לאחר מכן בצע דיגיטציה של התמונות באמצעות סורק Nikon Super cool scan 9,000 ED בגודל פיקסל של 6.35 מיקרומטר.

ניתן להוסיף לאינדקס אובייקט סלילי על ידי שני פרמטרים. סדר בסל N ומספר קו השכבה L בהתמרת הפורר של סריג פני השטח של אובייקט סלילי. כל קו שכבה מאופיין ב-N ו-L ומתאים לקבוצת קווים על סריג פני השטח כפי שמסומן במדדי H ו-K.

כדי להתחיל באינדקס סלילי, השתמש בתוכנית Helix boxer של אימאן כדי להוציא צינור ארוך וישר יחסית בקוטר אחיד ולשמור את התמונה בפורמט MRC. לאחר מכן מדוד את רדיוס הצינור באמצעות מתאגרף התוכנית של אימאן. קבע את מרחק החזרה של HEL באמצעות תוכנית מבוססת מתאם צולב כגון I-M-G-C-C-F בחבילת MRC.

לאחר מכן חשב את המבואה. שנה עם אורך תיבה חדש המהווה חלק בלתי נפרד ממרחק החזרה. לאחר מכן, בחר שני קווי שכבה עיקריים המגדירים שני וקטורים בסיסיים של סריג פני השטח אחד אפס ואפס אחד ביחידות של פיקסל FFT.

קבע את מספרי קווי השכבה וכן את רדיוסי המשרעת המקסימלית עבור שני קווי השכבה העיקריים בהתמרת פורייה. בהתחשב במספרי קווי השכבה והערכים של פקודות בסל עבור שני קווי השכבה העיקריים, ניתן להשיג את הסיבוב בין יחידות המשנה והעלייה הצירית של סליל הכוכב האחד באמצעות כלל הבחירה כמתואר בנוהל הכתוב. שני המספרים הממשיים הללו מתארים את סימטריית הבורג של הצינור.

שחזור תלת מימד מתחיל בסגמנטציה של חלקיקים באמצעות תוכנת אימאן. מתאגרף. לאחר פתיחת מיקרוגרף המכיל חלקיקים סליליים, חותכים חלקיק למקטעים חופפים בלוח הבקרה של בוקסר. בחר במצב סליל והגדר את הפרמטרים לאיגרוף.

גודל הקופסה צריך להיות גדול מקוטר החלקיק והערך עבור OLA צריך להיות כ-90% מגודל הקופסה. לאחר שמאל, לחיצה על שני קצות בוקסר החלקיקים תיצור אוטומטית סדרה של קופסאות חלקיקים לאורך הסליל, תשמור את הקטעים הקופסאות כמו גם את הקואורדינטות שלהם. השלב הבא הוא ביצוע שחזור תלת מימד ראשוני באמצעות שיטת שחזור החלל הסלילי, האיטרטיבית, I-H-R-S-R לפני העיבוד עם I-H-R-S-R.

הפוך את הניגודיות של תמונות cryo-EM והחל סינון LOWPASS. לאחר מכן פתח את הממשק הגרפי של תוכנית I-H-R-S-R על ידי מחולל הקלדה. ספק לממשק הגרפי את כל המידע עבור ערימת החלקיקים בקופסה, כולל השם והנתיב של המחסנית, מספר התמונות בערימה והערכים עבור פרמטרי סימטריה.

לחץ על כפתור הסיום כדי ליצור את סקריפט השחזור. B 25 SP. אני משתמש בצילינדר מוצק או חלול כהתייחסות ראשונית ומאפשר להליך לעבור מחזוריות עד שאין שינויים בסימטריית הבורג המוגדרת, המתרחשת בדרך כלל לאחר מספר מחזורים. סימטריה סלילית ימנית אמורה לתת שחזור מתכנס יציב.

השחזור שנוצר במחזור האחרון ישמש כאסמכתא ראשונית לחידוד נוסף. לבסוף, בצע שחזור תלת מימד עם עידון איטרטיבי באמצעות מפת הצפיפות התלת-ממדית שנוצרה על ידי I-H-R-S-R כהתייחסות ראשונית לעידון נוסף במהלך הליטוש. הסימטריה הסלילית קבועה בסיבוב בין יחידות משנה לעלייה צירית, הנקבעות מהליך I-H-R-S-R.

לאחר מכן, קבע את חוסר המיקוד והאסטיגמציה הקיימים במיקרוגרף באמצעות תוכניות CTF מוצא שלושה ו-CTF הטיה באמצעות תוכניות עכביש המכונות FT ו-mu מכפילים מקטעי חלקיקים על ידי פונקציית העברת הניגודיות. CTF מקוצר מבצע התאמת הקרנה על ידי השוואת הקרנות של נפחי הייחוס עם התמונות המתוקנות של CTF באמצעות יישור מרובה הפניות. השונות בזווית ההטיה הרגילה מוגבלת לפלוס או מינוס 10 מעלות ונדגמת בצעדים של מעלה אחת מציגה אילוצים כגון מקדמי מתאם גבוהים בזוויות רגילות ליד אפס מעלות או 180 מעלות והיסטי X מוגבלים.

עבור פרמטרי היישור של כל קטע כלול בשחזור רק את הקטעים העומדים באילוצים. לאחר כל מחזור עידון איטרטיבי, נוצר שחזור תלת מימדי באמצעות הקרנה לאחור ומחולק בחלק מעל ה-CTF בריבוע כופה את הסימטריה הסלילית כדי ליצור נפח סימטריות. הליטוש האיטרטיבי מסתיים כאשר לא מתרחש שיפור נוסף ברזולוציה של השחזור התלת-ממדי החדש.

מכלול קפסיד יחיד של HIV אחד, צינור 92 e, נארז החוצה והתמרת פורייה שלו מחושבת לאינדקס סלילי של שני הרדיוסים, נקבעו מספרי קווי השכבה ורדיוסי המשרעת המקסימלית עבור קווי שכבה אחד אפס ואפס אחד. ערכי הסיום של שלילי 12 ו-11 חושבו לאחר מכן עבור אפס אחד ואפס אחד בהתאמה עם מרחק חזרה של 5195.48 אנגסטרום. סימטריית הבורג של הצינור נקבעה כאשר דלתא Z שווה ל-6.81 אנגסטרומים ודלתא חמש שווה ל-328.88 מעלות, דלתא Z ודלתא חמש שוכללו ל-7.13 אנגסטרומים ו-328.86 מעלות באמצעות I-H-R-S-R ושחזור ראשוני נוצר לאחר 10 מחזורים איטרטיביים.

השחזור הסופי לאחר חידוד איטרטיבי שיפר את מפת הצפיפות באופן משמעותי מהמודל הראשוני שחושב עם I-H-R-S-R. מפת הצפיפות של צינורות הרכבת הקפסיד מוצגת כשלוש פרוסות אורתוגונליות במקביל לציר הצינור וקרוב לפני השטח, בניצב לציר הצינור ובמקביל לציר הצינור ודרכו. המבנה המוצג נובע מעיבוד פני השטח של מפת הצפיפות התלת מימדית המתארת ב-1.8 סיגמא הסוגרת 100% נפח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה מאוד כיצד להשיג מבנה תלת מימדי של מולקולה שהורכבה על ידי בעלי ברית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של עורב.