PDMS fabricación de dispositivos y modificación de la superficie

Mi nombre es Ken Kotz. Soy un postdoc aquí en el Centro de Recursos Bio MAs afiliado al Hospital General de Massachusetts. Mi principal proyecto de investigación consiste en aislar neutrófilos utilizando un dispositivo de captura de inmunoafinidad con estructuras microfluídicas.

Utilizamos este dispositivo en cinco hospitales diferentes de todo el país para aislar el ARN y realizar análisis genómicos posteriores. Básicamente, lo que tienes es un maestro de la fotorresistencia SU ocho encima de silicona. Vamos a verter un elastómero de dos partes A-P-D-M-S encima de ese maestro y ese PDMS formará un molde.

Sacamos el molde maestro de su caja y lo colocamos en una placa de Petri. El maestro está asegurado con cinta adhesiva en la parte inferior de una placa de Petri. En la báscula pesamos una mezcla de PDMS, endurecedor y resina base.

La proporción es de una parte de endurecedor por 10 partes de resina. Por lo general, para nuestros dispositivos que se han cortado, pesamos de 20 a 30 gramos de resina y de dos a tres gramos respectivamente del endurecedor. Después de verter tanto el endurecedor como la resina en el pequeño bote de suero, usamos un tenedor de plástico estándar para mezclar los dos.

Debes asegurarte de mezclar vigorosamente y doblar la mezcla una encima de la otra para asegurarte de que el endurecedor se distribuya uniformemente dentro de la resina. Por lo general, monitoreamos qué tan bien se han mezclado los dos. Al observar el número de burbujas de aire, intentamos obtener una distribución uniforme de pequeñas burbujas de aire en todo el elastómero.

A continuación, vertimos el PDMS sobre el maestro SU eight que está en la placa de Petri. Colocamos el master con el PDMS encima en una campana de vacío, y evacuamos la cámara para desgasificar el aire que hemos mezclado en ella. Por lo general, el proceso de desgasificación tarda entre 30 minutos y una hora.

Después de la desgasificación, retiramos los dispositivos de la cámara de vacío y los colocamos en un horno a 65 a 80 grados C. El tiempo mínimo de curado a estas temperaturas es de tres a seis horas. En nuestro laboratorio, normalmente dejamos los dispositivos en el horno durante la noche.

Por lo general, utilizamos un cuchillo de acero quirúrgico número 11. Hacemos cortes rectos a aproximadamente medio centímetro del borde del maestro de silicio, y cortamos alrededor del borde del maestro haciendo un disco grande. Pelamos el molde de PDMS del maestro y colocamos el lado de la característica hacia arriba en una placa de Petri limpia.

Sacamos el molde liberado de la placa de Petri y lo colocamos sobre una superficie de corte utilizando un cuchillo o un cuchillo montado en un riel lineal. Seccionamos los dispositivos que están contenidos en el molde. A continuación, cada dispositivo de sección se vuelve a colocar en la placa de Petri para su posterior procesamiento.

Por lo general, para interconectar nuestros dispositivos con fluidos, perforaremos agujeros en el dispositivo PDMS. El dispositivo que utilizamos para perforar agujeros es una jeringa estándar de tres molinos. En la punta de la jeringa de tres molinos hay una aguja de acero inoxidable de punta roma.

Dentro de la aguja de acero inoxidable hay un alambre que se ajusta al diámetro interior de la aguja. Ese cable está conectado al émbolo de la jeringa Al tirar hacia atrás del émbolo y retraer esa aguja, puede perforar un agujero o perforar un tapón en el PDMS. Voltee el dispositivo PDMS y expulse empujando el émbolo.

El secreto de los dispositivos de perforación es mantener el émbolo lo más vertical posible y no girar el dispositivo de perforación en absoluto. Cuando perforas el PDMS, levantas todo el dispositivo, todo el dispositivo PDMS con un par de pinzas, le das la vuelta y expulsas el enchufe presionando el émbolo. Agarras el enchufe con un par de pinzas y lo desechas.

A continuación, vuelve a retraer el émbolo, vuelve a bajar el dispositivo y saca el dispositivo de corte. Repite esto hasta que tengas todos los agujeros perforados. Por lo tanto, para el proceso de unión, unimos nuestros dispositivos PDMS a portaobjetos de vidrio.

En el caso de nuestros dispositivos, vamos a unir de forma no reversible o acoplar covalentemente el PDMS a portaobjetos de vidrio. La forma en que esto se logra es colocándolos en un, colocándolos en un Asher de plasma y exponiéndolos a un plasma de oxígeno reactivo. Por lo tanto, los pasos para hacer esto son tomar el dispositivo PDMS y colocarlo en la bandeja del Asher de plasma.

Con las características del dispositivo hacia arriba, puede utilizar cualquier portaobjetos de microscopio de vidrio estándar. Usamos un portaobjetos de microscopio ligeramente agrandado de una pulgada y media para adaptarse a nuestro dispositivo. Puede usarlos directamente del paquete.

Preferimos tratarlos en una solución de piraña. Esto limpia cualquier contaminante orgánico que pueda haber en la superficie del portaobjetos de vidrio. Después de colocar el dispositivo y la corredera de vidrio en la parte superior de la bandeja para el Asher de plasma, deslice la bandeja en el Asher de plasma y exponga al plasma de oxígeno reactivo.

Una vez finalizado el programa del asher de plasma, abrimos la cámara y retiramos la placa con nuestros dispositivos hasta la mesa de trabajo. Con pinzas, levantamos con cuidado el dispositivo PDMS, teniendo cuidado de no tocar las superficies de unión con los dedos. Volteamos el lado de unión sobre el vidrio, sobre el portaobjetos de vidrio, y luego nos aseguramos de que no haya burbujas de aire entre el PDMS y el portaobjetos de vidrio.

Colocamos el dispositivo PDMS ahora adherido al vidrio en una placa caliente a 65 a 75 grados C durante 10 minutos para lograr una mejor unión química. Así que en esta parte, en esta sección, vamos a modificar químicamente las superficies del PDMS en el vidrio después de la unión en la sala limpia, nos queda una superficie A superficie PMS que tiene grupos OL reactivos en la superficie. Necesitamos que esta superficie reactiva sea hidrófila y eventualmente se difunda en la mayor parte del PMS.

Por lo tanto, la química de la superficie se logra mejor inmediatamente después del tratamiento con plasma, vamos a usar una solución al 5% de un me capto. Es un tres me capto, propil, trimeth oxy. Es una solución del 5% por volumen, y básicamente lo que hacemos es inyectarlo en la entrada y asegurarnos de que llene completamente el dispositivo sin burbujas de aire.

Si hay burbujas de aire, las empuja hacia afuera con pinzas. Una vez que hayas inyectado el slan, lo dejas reposar durante 15 a 30 minutos. A temperatura ambiente, por lo general, inyectamos un segundo volumen de slan 10 minutos en la reacción.

Entonces, después de que el cilindro haya reaccionado durante aproximadamente media hora, tomaremos un lavado de todos los dispositivos con tres o cuatro volúmenes de etanol puro. El exceso que expulsamos simplemente se limpiará con una toallita química Después de enjuagar los dispositivos, recogemos los dispositivos y los colocamos en una placa caliente, que está configurada a cien grados C, y básicamente dejaremos que el etanol que está allí se evapore. Esto ayuda a arrodillar la superficie de sedimentación.

Una vez que el dispositivo se seca, se puede almacenar en un desecado durante meses o puede, puede tomar el dispositivo e inmediatamente continuar con el siguiente paso. Una vez que los dispositivos se han curado, se han curado con una capa sinusoidal tanto en el vidrio como en la superficie del PDMS. El seno es un seno a capto con el grupo tiol, que reaccionará con nuestro reticulante hetero bifuncional, que es GMBS.

Se diluye en etanol puro. Es reactivo al agua, por lo que debe tener cuidado de no exponerlo a condiciones acuosas. Lo inyectamos en los dispositivos y eliminamos las burbujas de aire con pinzas como estoy haciendo aquí para asegurarnos de que todas las superficies estén unidas con esta molécula.

Lo tapamos y dejamos que reaccione durante media hora. Después de que el GMBS haya reaccionado durante media hora, vamos a enjuagar los dispositivos con agua desionizada para eliminar cualquier rastro de etanol que haya en el dispositivo. Y luego vamos a fluir a través de la neu travaína, que es la proteína de unión a la biotina.

A continuación, la neu travaína se diluye previamente a una concentración de 10 microgramos por mil. Si, si se inyecta aire accidentalmente en el dispositivo, el dispositivo deberá volver a enjuagarse con etanol para eliminar eficazmente todo el aire que moja el etanol, el dispositivo se superficie mejor y le permite eliminar cualquier burbuja de aire que se haya introducido accidentalmente en el dispositivo. Y una vez que los dispositivos se han enjuagado con agua ionizada, generalmente llenamos el dispositivo con dos a cuatro volúmenes de dispositivo de la solución diluida de travaína T de evidencia neutra.

La travaína Nutt reaccionará con el GMBS, que se inmoviliza a la superficie a través de cualquier medio primario en la travaína Nutt. Este proceso puede ocurrir a temperatura ambiente durante una hora. Por lo general, coloco los dispositivos en la cámara frigorífica a cuatro grados C durante la noche.

Sin embargo, antes de agregar el anticuerpo, queremos eliminar cualquier Adén, que no esté unido a la solución. Y lo hacemos fluyendo a través de una solución BSA al 1% diluida en PBS. Debido a que estos chips se van a utilizar para el análisis genómico posterior, todas las soluciones que utilizamos están libres de ARN.

Por lo general, lo que hacemos es vaciar el dispositivo con cuatro o cinco volúmenes de la solución 1%BSA. Y luego, después de eso, agregamos nuestro anticuerpo. El anticuerpo para este experimento es el CD 66 B y los anticuerpos específicos contra los granulocitos en la sangre total.

Usamos una concentración de entre 10 y 25 microgramos por mil, e inyectamos el anticuerpo. Inyectaremos 200 microlitros de anticuerpo en cada dispositivo. Haremos dos inyecciones de cien microlitros, una en cada puerto del dispositivo.

Por lo general, inyectaremos cien microlitros en un puerto, esperaremos 30 minutos e inyectaremos cien microlitros adicionales en el puerto opuesto.