改良酵母双杂交系统，以确定蛋白与生长因子Progranulin的相互作用

这种 MY two H 系统改进了传统的酵母 2 杂交方案，显著减少了假阳性的数量。首先，准备将诱饵质粒小规模转化到酵母中。使用竞争性抑制剂验证诱饵构建体后，在减去四个板上筛选 cDNA 文库。

继续用 XGL 和 reation 测定验证阳性克隆。然后通过 DNA 测序和生物信息学分析鉴定潜在的相互作用蛋白质。最终，这种改良的酵母双杂交系统显著提高了筛选过程的效率和成功率。

传统的酵母双杂交系统因产生正能量而臭名昭著。此消息显示修改后的筛选过程，该过程得到了显著改进，有利于使用两点尾部。那么让我们开始吧。

用 5 毫升 MAV 2 0 3 过夜培养物接种 50 毫升 YPD。在 30 摄氏度下生长 2 到 4 小时。然后离心收获酵母，洗涤一次后，将沉淀重悬于 2 毫升溶液 1 中，并在室温下孵育 10 分钟。

准备用于转化的 DNA 混合物。加入 100 微升酵母细胞并充分混合。然后加入 700 微升溶液 2 并充分混合。

先在 30 摄氏度下孵育 30 分钟，然后热休克。细胞现在通过离心收获细胞，并将沉淀重悬于 200 μL 高压灭菌蒸馏水中，将悬浮液的连续稀释液涂抹在 SD LU 板上，在 30 摄氏度下孵育 2 至 3 天。此步骤证实诱饵质粒激活转录，并且这种自我激活可以被抑制剂中和，例如 3 在 hiss 3 基因产物的竞争性抑制剂中。

首先，将诱饵质粒转化到 MAV 2 0 3 酵母中。将反应分散在 SD LU 板上并在 30 摄氏度下孵育。为了在诱导的自激活时筛选 3 个集落，使用高压灭菌器牙签将每个转化的集落修补到在 30 摄氏度孵育板上含有浓度递增的 3 的 SD LU 嘶嘶声板上。

消除在含有 100 毫摩尔的板子上生长的诱饵菌株 3 at 不适合在两个混合筛网中使用 re。对于剩余的诱饵，选择抑制细胞生长的浓度最低的三个用于 CD NA 文库筛选，将几个含有诱饵质粒的分离酵母菌落悬浮在 100 微升高压灭菌蒸馏水中。将它们铺在两个 10 厘米的 SD LU 板上。

在 30 摄氏度下孵育两个板。刮擦并完全悬浮 10 毫升的细胞。高压灭菌蒸馏水并接种 500 毫升液体 YPD。中等。

通过光谱、光度测定和在 30 摄氏度下培养来验证细胞密度。继续通过离心收获细胞。在 100 毫升中洗涤一次，用蒸馏水高压灭菌，在 50 毫升溶液 1 中洗涤一次。

然后将沉淀重悬于 2.5 mL 溶液 1 中。现在加入变性的剪切鲑鱼精子 DNA，以及通过移液轻轻混合的 CD NA 文库。然后加入 15 毫升含有 40% 聚乙二醇的溶液二。

轻轻混合，将 700 微升等分试样分配到 25 个高压灭菌器中。将 1.5 毫升微量离心管在 30 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟，然后热休克 15 分钟。在 42 摄氏度的水浴中。

通过离心收获细胞，轻轻地将每个沉淀重悬于 400 μL 高压灭菌蒸馏水中。将每种转化混合物涂在两个选择板上，并在 30 摄氏度下孵育 5 至 10 天，作为反应板转化效率的对照估计值。一个反应的连续稀释液。

在 30 摄氏度下孵育 3 天后，确定总菌落数。将菌落转移到 YPD 板上，并在 30 摄氏度下孵育过夜。然后将圆形硝酸纤维素膜直接放在 YPD 板上，确保没有气泡。

一分钟后，检查所有菌落是否都转移到膜上。将膜集落面朝上放在铝箔舟中，并将其放在液氮表面 20 秒。然后浸入液氮中几分钟。

现在去除膜以解冻。同时，用新鲜的 XCA 溶液层 Aman 纸准备一个培养皿。然后小心地浸入解冻的膜并在 37 摄氏度下孵育。

直到出现蓝色菌落。将猎物、克隆和诱饵构建体重新放入酵母中可以进一步消除假阳性。首先，从可能含有相互作用蛋白的酵母菌株中分离质粒 DNA。

将 DNA 转化到大肠杆菌 DH 5 α 中，并通过在 LB 氨苄青霉素板上的生长进行选择。通过限制性内切酶分析筛选转化体。现在将猎物和诱饵质粒共转化到 SC LU 行程板上的酵母 MAV 2 0 3 板中，并在 30 摄氏度下孵育两到三天。

选择三个不同的菌落进行 xal 检测序列，从阳性克隆中挑选质粒 DNA，并使用生物信息学鉴定基因。在这个实验中。以 Rine 生长因子原颗粒蛋白为诱饵，筛选脑 CD NA 文库 54 阳性克隆。

候选人是从 250 万中分离出来的。用 pro granulin 诱饵筛选转化体。通过颅骨前测定的进一步分析表明，前颗粒蛋白诱饵有 23 个阳性克隆候选者。

有趣的是，测序数据的生物信息学分析确定了 TNF R 2。事实上。进一步的功能实验证实颗粒蛋白前体是 TT NF 受体的新型配体。观看此视频后，您应该对如何使用您感兴趣的基础执行这种改进的二手混合屏幕有很好的了解。

不要忘记戴手套工作，因为使用的某些区域是危险的。祝你的实验好运。