تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح استخدام الجليكوسات لإزالة الجليكوزيلات الأنزيمية وتحليل الجليكوزيل المرتبط n و O على نموذج البروتين السكري. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة البروتين السكري باستخدام PGA's F أو بمزيج إزالة السكر من البروتين. أيضا ، تم استكمال مزيج إزالة السكر من البروتين بمزيج من الحمار الإضافي exo glyco ، والذي يساعد أحيانا في إزالة السكريات المقاومة.

نوضح هذه الطريقة باستخدام نموذج بروتين سكري مؤتلف موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية بيتا ، أو HCG beta صفحة SDS التالية ، متبوعا بتلطيخ كوماسي الأزرق وطريقة تلطيخ خاصة بالسكر. تستخدم Pro Q Emerald 300 لتحليل D glycosylated. يتم الحصول على نتائج عينة بيتا HCG ، والتي تظهر أن HCG beta يحتوي على جليكوزيل بشكل غير متجانس ويحتوي على أشكال متعددة من الجليكوسات بناء على الاختلافات في هجرة البروتين مع وبدون علاج الجليكوسات والإشارة المتضائلة على تلطيخ ProQ حيث تتم إزالة الجليكان على التوالي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل تحليل قياس الطيف الكتلي ، هي أنها بسيطة وتستخدم معدات معملية شائعة وجيدة لعالم الأحياء الجليكو المبتدئ. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الجليكو ، مثل البروتين الخاص بي القابل للغليكوزيلات. لبدء إزالة السكر الأنزيمي ، قم بإذابة المخازن المؤقتة الموردة من مجموعة إزالة السكر من البروتين.

امزج الأنابيب جيدا واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة. ضع الإنزيم المحتوي على قوارير على الثلج ، وقم بإذابة محتويات قارورة بيتا HCG في 600 ميكرولتر من الماء المقطر واحتفظ بها على الثلج. بعد تحضير مليلتر واحد من مخزن مؤقت XG سبعة عن طريق تخفيف 10 × المخزون في الماء المقطر ، استخدم 25 ميكرولترا لتخفيف 0.5 ميكرولتر من PGA.

تحضير مزيج جليكوزات exo عن طريق الجمع بين ميكرولترين ، كل من أمراض exo glyco الأربعة. بعد ذلك ، أضف HCG beta و 10 × محلول تغيير طبيعة البروتين السكري إلى سبعة أنابيب PCR مرقمة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ، وقم بتغطية الأنابيب واخلطها برفق لتغيير طبيعة البروتينات في جهاز التحكم الحراري عن طريق احتضان 10 دقائق عند 94 درجة مئوية ، متبوعا بأربع درجات مئوية بعد إزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الحراري لإزالة أي تكاثف مرئي لكل أنبوب تفاعل ، أضف الكواشف المتبقية وفقا للبروتوكول المكتوب. أغلق أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أغطية جديدة.

ثم امزج الأنابيب عن طريق النقر برفق أربع مرات بعد تدوير المحتويات ، ضع الأنابيب في حضانة المدورة الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. يتبع ذلك تبريد العينات إلى أربع درجات مئوية. لإعداد صفحة SDS ، قم بإعداد مخزن مؤقت جديد لتحميل SDS ثلاثة ×.

باستخدام DTT ، أضف 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل SDS المحضر ثلاثة × إلى كل عينة ، أغلق الأنابيب بأغطية جديدة واضغط برفق على الأنابيب للخلط. احتضان الأنابيب في جهاز تدوير حراري عند 94 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم تبرد إلى أربع درجات مئوية بعد حمل الحضانة ، 30 ميكرولتر من كل عينة و 10 ميكرولتر من علامة البروتين على هلام ثلاثي جلايسين من 10 إلى 20٪. حفظ باقي كل عينة.

قم بإلكترود الجل عند 130 فولت حتى تصبح الجبهة D بالقرب من قاع الجل. عند انتهاء تشغيل الجل ، قم بإزالة الجل من الجبيرة وضعه في صندوق بلاستيكي صغير به بقعة زرقاء كافية من كوماسي لتغطية بقعة الجل. الجل لمدة ساعة واحدة مع تحريض لطيف بعد تلطيخ الجل.

يغسل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة. في 50 مل من محلول الاحتجاز ، سجل الصور باستخدام جهاز المصباح أو الماسح الضوئي للضوء الأبيض. بدلا من ذلك ، يمكن تجفيف الجل بين صفائح السيلوفان.

في إطار ، قم بتشغيل الباقي من كل عينة وعلامة بروتين على هلام ثلاثي جلايسين من 10 إلى 20٪ أثناء تشغيل الجل. قم بإذابة كاشف الزمرد ProQ باستخدام DMF وقم بإعداد محاليل إصلاح المخزون والغسيل والأكسدة للبقعة باتباع دليل المنتج المرفق مع المجموعة. عند اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل من الجبيرة وضعه في صندوق بلاستيكي.

إصلاح الجل عن طريق إضافة 100 مل من المحلول الثابت المحضر. اترك الجل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف في اليوم التالي. اغسل الجل ب 100 مل من محلول الغسيل المحضر لمدة 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف ، وكرر الغسيل مرة ثانية بمحلول غسيل طازج.

بعد ذلك ، قم بتأكسد الكربوهيدرات عن طريق احتضان الجل بتحريض لطيف لمدة 30 دقيقة في 25 مل من المحلول المؤكسد المحضر ، واتبع الحضانة بغسلتين إضافيتين أثناء غسل الجل. قم بإعداد صبغة ProQ emerald 300 الطازجة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول كاشف ProQ Emerald 300 إلى 25 مل من مخزن التلوين الموجود في المجموعة. تلطيخ الجل عن طريق احتضانه في البقعة المحضرة في ظل الظروف المظلمة مع تحريك لطيف لمدة 90 إلى 120 دقيقة بعد تلطيخ الجل.

كرر خطوتي الغسيل كما هو موضح سابقا. ثم سجل الصور باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية العابرة عند 300 نانومتر. كخطوة أخيرة ، قارن صور جل الكوماسي الملون مع جل بقع الزمرد ProQ.

يمكن رؤية التغييرات في هجرة البروتين بعد إزالة السكر الأنزيمي عند مقارنة عينة التحكم بعلاج F الخاص ب PGA. لإزالة n glycans وإلى معالجة مزيج Deglycosylation لإزالة n و O glycans ، لا يلاحظ أي انخفاض إضافي في الحجم بعد الهضم مع جليكوسات إضافية. إلى جانب التغيير في الكتلة ، تصبح العصابات أكثر حدة مع إزالة الجليكانات.

المحتمل أن يمثل النطاق الذي يمتد تحت علامة 17 كيلوڈالتون بولي ببتيد بيتا deglycosylate بالكامل. تظهر الممرات من خمسة إلى سبعة النطاقات المقابلة ل Glyco. قد تنبع النطاقات الأخرى من إزالة الجليكوزيل غير المكتمل أو من بروتينات متعددة غير محددة الهوية موجودة في عينة بيتا HCG.

يؤكسد الكاشف الأخضر الزمردي ويلطخ جميع الجليكان الموجودة في جزيء البروتين. لذلك ، تنخفض شدة الإشارة حيث يتم غليكوزيلات خلايا التناسق HCG بيتا إنزيميا. تشير الإشارة المتبقية في الممر الثالث والرابع إلى وجود أشكال الجليكان المقاومة للإنزيمات المستخدمة.

يتم استخدام الجليكوسات الإضافية في الممر الرابع. قم بإزالة بعض بقايا السكر الإضافية. هجرة البروتين هي نفسها ، ولكن يمكن ملاحظة انخفاض طفيف في شدة التلوين.

لم تكن شقوق السكر المقاومة موجودة في جميع أنواع البروتين. لم يتم الكشف عن بعض العصابات بواسطة الزمرد الأخضر مما يشير إلى أنها كانت على نطاق واسع deglycosylated بيانات إضافية تدعم الاستنتاج القائل بأن بيتا قوات حرس السواحل الهايتية غير متجانسة. النطاق السفلي في الممر الثاني باهت على الصورة الخضراء الزمردية.

في حين أن النطاق العلوي في الممر الثاني ساطع مما يشير إلى أن العديد من مجموعات GLYCAN لا تزال موجودة ، فإن هذه البيانات تدعم الاستنتاج القائل بأن بيتا HCG المؤتلف المعبر عنه في خلايا الفأر يحتوي على أشكال متعددة من الجليكو بسبب عدم التجانس المتأصل في الارتباط بالجليكوزيل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس الطيف الكتلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، ما هو معدل الإشغال؟ ما هو مدى الارتباط بالجليكوزيل ، أو ما هو التركيب الدقيق للجليكانات؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الجليكوزيلات في إزالة الجليكوزيلات الأنزيمية وتحليل الجليكان المرتبط ب NNO. على البروتينات السكرية. قد يكون اختيار الكشف صعبا لأن مناطق تلطين البروتين مفيدة فقط إذا أدى الارتباط بالجليكوزيل إلى تحول كبير في الكتلة الجزيئية للبروتينات الأخرى.

لقد رأينا هجرات غير طبيعية بعد إزالة الارتباط بالجليكوزيل ووجدنا أن أي تغيير في الهجرة هو دليل على أن البروتين قد تم إزالة الجليكوزيلات.