في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد قدرة الستيرويدات متعددة الخلايا لسرطان المبيض على غزو طبقة أحادية الظهارة المتوسطة. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان البروتين الفلوري الأحمر أولا الذي يعبر عن خلايا سرطان المبيض في صفائح ثقافة منخفضة الالتصاق لتشكيل ستيرويدات متعددة الخلايا. الخطوة التالية هي صفيحة البروتين الفلوري الأخضر الذي يعبر عن الخلايا المتوسطة على أطباق ثقافة القاع الزجاجي المطلي بالفيبرونيكتين لتشكيل طبقات أحادية.

الخطوة الأخيرة هي نقل درجة الحموضة لسرطان المبيض من ألواح الالتصاق المنخفضة إلى الصفائح التي تحتوي على الطبقات الأحادية الظهارية المتوسطة. في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني مضان لتحديد القدرة النسبية للسيطرة وسرطان المبيض التجريبي. SP لتشكيل كل في الطبقة الأحادية المتوسطة الظهارية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على فحوصات نقطة النهاية الحالية هي أنه يتم استخدام مزيج من الخلايا المصنفة بالفلورسنت والفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني لمراقبة ديناميكيات التصفية المتوسطة بمرور الوقت قبل تكوين درجة حرارة سرطان المبيض ، من الضروري تحضير التصاق منخفض. 96 طبق ثقافة ذو قاع مستدير جيدا. لإنتاج أطباق الثقافة هذه ، أضف 30 ميكرولترا من محلول بولي هيما إلى كل بئر من طبق ثقافة خلايا 96 جيدا.

احتضان 96 لوحة بئر في حاضنة غير مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة لتبخر الإيثانول ، مع ترك فيلم من بولي هيما على كل منها. حسنا ، يمنع فيلم بولي هيما هذا الخلايا من الالتصاق بقاع البئر ، مما يجبر الخلايا على النمو في حالة تعليق. يتم زراعة البروتين الفلوري الأحمر الذي يعبر عن خلايا سرطان المبيض في هذه التجربة في وسط أساسي بنسبة 10٪ ، وهو وسيط مخصص لزراعة الخلايا عندما تكون ألواح الثقافة منخفضة الالتصاق جاهزة.

التربسين عبارة عن صفيحة من خلايا سرطان المبيض عن طريق غسل اللوحة أولا باستخدام PBS ، ثم إضافة مليلتر واحد من التربسين واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية أربع خمس دقائق. بعد إضافة 10٪ من الوسط الأساسي لإخماد التربسين ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي سعة 15 مل. قم بتكسير الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدي عند 900 RCF لمدة ثلاث دقائق ، واستنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط أساسي بنسبة 10٪.

بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، اضبط تركيز الخلايا على 100 خلية لكل 50 ميكرولتر من 10٪ متوسط أساسي أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية المخفف المعلق بشكل موحد إلى كل بئر من طبق الثقافة المطلي ب 96 جيدا بولي هيما يحتضن لوحة 96 بئر في حاضنة ثقافة خلايا 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة للسماح لخلايا سرطان المبيض بالتجمع معا ، تشكيل الستيرويد متعدد الخلايا واحد في كل بئر. لبدء هذا الإجراء ، قم بتجهيز آبار طبق تقني من ستة آبار زجاجية مع فيبرونكتين. أضف ملليلترين من محلول فيبرونيكتين PBS إلى كل بئر من الطبق واحتضنه في درجة حرارة الغرفة B لمدة 30 دقيقة.

البروتين الفلوري الأخضر الذي يعبر عن خلايا الظهارة المتوسطة لتشكيل طبقة أحادية لخلية الظهارة المتوسطة ، قمنا بزراعته في عيون التربسين المتوسطة المتوسطة بنسبة 10٪ ، وهي صفيحة من خلايا الظهارة المتوسطة وتدور لأسفل في جهاز طرد مركزي منضدية بسرعة 900 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. قم بشفط الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 10٪ وسط أساسي ، واضبط التركيز المطلوب مع 10٪ الوسط الأساسي. عندما تكتمل حضانة الفيبرونيكتين لمدة 30 دقيقة لطبق تقنية الحصيرة ، اغسل الآبار بملليلترين من PBS ، واستنشق PBS والصفيحة ستة أضعاف 10 إلى الخلايا المتوسطة الخامسة لكل بئر في كل بئر من الطبق التقني الستة حصيرة.

احتضان طبق تقنية الحصيرة في حاضنة زراعة الخلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للخلايا المتوسطة بالالتصاق بالطبق وتشكيل طبقة أحادية. لبدء هذا الفحص ، استخدم ماصة لجمع PHE لسرطان المبيض من الصفيحة المطلية ب 96 Well poly hema ، واستنشق الوسط من بئر واحد من ستة أطباق تقنية حصيرة جيدة تحتوي على طبقة أحادية الطبقة من خلية الظهارة المتوسطة مرة واحدة مع ملليلترين من PBS ، أضف كل PHE من صفيحة الحوت 96 إلى بئر واحد من طبق ماتيك. هذا هو ما يقرب من ثلاثة أضعاف عدد الستيرويد التي سيتم تصويرها لحساب هبوط PHE على جزء من الطبق الذي لا يمكن تصويره.

نظرا لأننا نريد تصوير ستيرويد واحد فقط في مجال الرؤية ، يجب تجنب تجميع الستيرويد. هز الطبق برفق من جانب إلى آخر لتوزيع المنشطات بالتساوي عبر أحادية الطبقة قبل أن يعلقها. ضع طبق تقنية الحصيرة على مسرح مجهر مضان واسع المجال مقلوب.

قادر على إجراء تصوير بفاصل زمني لمدة ثماني ساعات على الأقل. استخدم مرحلة آلية لتصوير مواضع متعددة في الطبق مع العديد من أحداث الترتيب بين OID. في تجربة واحدة ، ستستقر خلية سرطان المبيض PHE في قاع الطبق وتلتصق بخلية الظهارة المتوسطة.

الطبقة الأحادية صور G-F-P-R-F-P وصور الطور ل 20 تفاعلا أحادي الطبقة كل 10 دقائق لمدة ثماني ساعات. في مقايسة إزالة الخلايا الظهارية المتوسطة ، فإن RFP الذي يعبر عن PHE لخلية سرطان المبيض سيغزو GFP معبرا عن طبقة أحادية للخلية المتوسطة تخلق ثقوبا في الطبقة الواحدة. يتم قياس أحجام الثقوب عن طريق تتبع الثقوب السوداء في صور GFP باستخدام برنامج عنصر أو برنامج مناسب آخر مثل Image J ، ثم يتم تطبيع حجم الثقب إلى الحجم الكروي الأولي بقسمة حجم الثقب في ثماني ساعات على حجم الستيرويد في صورة RFP المقابلة في أوقات الصفر ، يمكن استخدام مقايسة إزالة الخلايا الظهارية المتوسطة لمقارنة قدرة غزو SPHE لخلايا سرطان المبيض التي تم تعديلها وراثيا لتوضيح الآليات الجزيئية التي من خلالها الستيرويد لخلايا سرطان المبيض واضحة.

الطبقة الأحادية الظهارية المتوسطة في هذا المثال ، قدرة إزالة الظهارة المتوسطة ل O VCA 4 33 خلايا سرطان المبيض. تمت مقارنة الدرجة الحموضة التي خففت من التعبير عن Talon one بتلك الخاصة بالتحكم OVCA 4 33 OIDs. تم قياس الثقوب الناتجة في الطبقة الأحادية بواسطة PHE المنتشرة وتم حساب متوسط ستة مواضع من كل مجموعة.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني, كان متوسط منطقة التخليص التي تم إنشاؤها بواسطة Talon one ضربة قاضية المنشطات أصغر بكثير من متوسط المساحة التي تم إنشاؤها بواسطة المنشطات التحكم مما يشير إلى أن تالون مطلوب لإزالة الظهارة المتوسطة بواسطة OVCA 4 33 SPS سرطان المبيض. يظهر فيلم الفاصل الزمني هذا التحكم في OVCA 4 33 الستيرويد الأحمر الذي يغزو طبقة أحادية الظهارة المتوسطة الخضراء. هذا الفيلم بفاصل زمني التالي هو من الستيرويد الأحمر OVCA 4 33 مع تعبير موهن عن Talon واحد يغزو إلى طبقة أحادية الظهارة المتوسطة الخضراء.

عند مقارنتها بالفيلم السابق ، من الواضح أن توهين تعبير تالون في المنشطات يقلل من قدرة إزالة الظهارة المتوسطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة تفاعل سرطان المبيض والستيرويدات متعددة الخلايا والطبقات الأحادية للخلايا المتوسطة بمرور الوقت باستخدام الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني.