연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경 Aplysia

세포 내 칼슘은 시냅스 가소성의 여러 메커니즘의 중요한 부분으로 암시되어 왔습니다. 이러한 아이디어는 칼슘의 변화와 시냅스 효능의 변화를 동시에 모니터링하여 테스트할 수 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징과 세포 내 기록을 결합하여 이를 수행하는 방법을 보여줍니다.

우리의 실험은 연체동물 Aplysia Cahora의 신경절로 수행됩니다. 이 제제는 크게 식별된 뉴런, 아피아에 자연스러운 낮은 온도, 느린 신호 및 이미징 용이와 같은 여러 가지 장점이 있지만 우리가 보여주는 일반적인 기술은 다른 시스템으로 쉽게 이전됩니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕시 마운트 시나이 의과대학의 피시버그 신경과학과 프리드먼 뇌 연구소의 엘리자베스 크로퍼 실험실에서 근무하는 콜린 에반스입니다.

오늘, 우리는 연체동물 Aplysia cahora의 협측 신경절에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅스 효능의 변화를 동시에 이미징하는 방법을 시연할 것입니다. 세포 내 칼슘을 검출하기 위해 시냅스 전 뉴런에 세포 IMP 투과성 칼슘 지시약 염료 칼슘 오렌지를 주입합니다. 그런 다음 제제를 현미경으로 옮기고 시냅스 전후 뉴런을 날카로운 전극으로 찔러넣습니다.

반복적인 시냅스전 자극은 시냅스후 전위(postsynaptic potential) 또는 PSP 진폭(PSP amplitude)이 증가하는 것으로 보이는 향상된 시냅스후 반응을 초래합니다. 칼슘 지시약 염료의 형광 신호를 측정하면 시냅스전 세포 내 칼슘의 동시 변화를 감지할 수 있습니다. 체중이 약 150g인 성인 동물을 마취하기 위해 75mil의 등장성 염화마그네슘 용액을 주입하고 마취된 동물을 밀랍으로 덮인 접시에 고정한 다음 총겨와 가위를 사용하여 동물의 발을 절개하고 협측 덩어리를 노출시킵니다.

협측 신경절은 협측 종괴의 복부 쪽에 위치하며 두 개의 연결된 반신경절로 구성됩니다. 그것은 다른 신경절의 뉴런과 함께 동물의 섭식 행동의 생성과 제어에 기여하는 수백 개의 뉴런을 포함하고 있습니다. 가느다란 가위로 좌굴된 모든 신경을 잘라 신경절을 조심스럽게 빼내고 동물에게서 제거합니다.

그런 다음 해제된 신경절을 인공 바닷물로 채워진 실 가드 코팅된 접시의 바닥에 고정합니다. 신경절은 결합 조직의 덮개로 싸여 있으며, 개별 뉴런을 노출시키기 위해 이를 제거해야 합니다. 확인 집게, 홍채 가위 및 극도의 주의를 사용하여 이 덮개를 잘라냅니다.

뉴런의 손상을 피하려면, 영상 촬영 중 어떤 움직임도 문제가 될 수 있으므로 약 15분 핀으로 초막 신경절을 안정화하십시오. 세포 내 기록 및 염료 주입을 위해 날카로운 전극을 준비하려면 마이크로 전극 풀러로 모세관 튜브를 당깁니다. 우리는 외경이 1mm인 얇은 벽의 필라멘트 보아 규산염 유리를 사용합니다.

기록 전극은 3개의 몰 아세트산 칼륨으로 채워질 때 약 10메가의 저항을 가져야 하므로 그에 따라 풀러를 조정하여 D 전극을 채웁니다. 당겨진 전극의 뒷면을 전극 내부의 유리 필라멘트를 따라 칼슘 오렌지 염료 모세관 작용의 10 밀리 몰 용액에 담그면 염료가 팁으로 끌어 당겨진 다음 200 밀리 몰의 염화칼륨으로 전극을 다시 채워 양호한 전기 접촉을 보장합니다. 우리는 맞춤형 Bela를 사용하여 전극 특성을 개선하고 기록 전극 저항을 약 5메가로 낮춥니다.

전극은 45도 각도로 산화알루미늄 현탁액의 흐름으로 유지됩니다. 염화나트륨을 현탁액에 혼합하고 ome meter를 연결하면 전극 저항을 모니터링 할 수 있습니다. 베벨링 과정에서 우리는 속임수를 쓴 버클 신경절이 들어있는 접시를 전기생리학 장비로 옮기고 전극으로 찔러서 정체를 확인하여 관심 뉴런을 찾습니다.

칼슘 이미징을 위한 뉴런을 준비하기 위해 먼저 염료로 채워진 전극을 세포 소마에 삽입하고 이론적으로 30분의 과분극, 15나노 암페어 전류 펄스로 염료를 전기적으로 로드합니다. D 칼슘 오렌지가 세포에 들어가면 SOR은 희미한 분홍색을 띠게 됩니다. 그런 다음 기록 전극을 조심스럽게 집어넣고 염료가 뉴런의 미세한 과정으로 확산될 수 있도록 제제를 최소 30분 동안 그대로 둡니다.

다음으로, 준비물과 함께 접시를 형광 현미경으로 옮깁니다. 우리는 정립 고정 스테이지 현미경에 10배 NA 0.3 수침 렌즈를 사용하며, 스테이지가 아닌 렌즈를 움직여 초점을 맞춥니다. 이렇게 하면 매니퓰레이터를 더 쉽게 장착할 수 있습니다.

기록 전극의 경우 적절한 필터 블록을 선택합니다. SI 3 필터 블록은 칼슘 오렌지에 대한 올바른 여기 및 방출 필터를 제공하고 중성 밀도 필터 및 자기장 조리개로 카메라 매개변수와 조명 강도를 조정합니다. 빛이 많을수록 소음이 줄어들지만 잠재적으로 준비물을 표백할 수 있습니다.

쿨 스냅 CCD 카메라는 초당 약 30프레임의 프레임 속도로 500 x 300 픽셀 필드를 캡처할 수 있으며 우수한 신호 대 노이즈 비율입니다. 가능하면 광원을 셔터를 닫아 두어 fil 뉴런의 조명을 최소화합니다. 이미징 소프트웨어에서 관심 영역 또는 R ois를 선택합니다.

이 영역은 소프트웨어가 강도를 측정하는 위치를 정의합니다. 우리는 일반적으로 시냅스전 뉴런의 1차, 2차 및 3차 가지를 이미지화합니다. difi 뉴런 옆에 추가 ROI를 배치하여 나중에 다른 모든 데이터 점에서 뺄 배경 값을 얻습니다.

시냅스 전후 뉴런의 세포 내 기록 전극은 시냅스 전달을 유도하고 모니터링하는 데 사용됩니다. 카메라의 프레임 아웃 트리거 신호를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어를 시작하는 경우 전기 생리학적 데이터 수집과 이미징 데이터 수집 간의 동기화를 보장할 수 있습니다. 동기화를 보장하는 또 다른 방법은 카메라 포트 내부에 LED를 장착하는 것입니다.

이 LED는 녹음 세션이 시작될 때 잠시 켜져 동기화 표시를 제공합니다. 일반적인 실험 중에는 짧은 전류 펄스를 주입하여 시냅스전 뉴런에서 활동 전위를 트리거합니다. 이 예에서는 특정 가설을 테스트하기 위해 스파이크의 폭발과 그에 따른 칼슘 신호의 증가를 보여줍니다.

칼슘 신호는 조작될 수 있고 시냅스 전달에 대한 영향을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 칼슘 킬레이터 EGTA와 같은 약물은 관류 시스템을 통해 시냅스 전에 주입하거나 적용할 수 있습니다. 데이터는 이미징 소프트웨어에서 텍스트 파일로 내보낸 다음 전기 생리학적 데이터를 획득하는 데 사용된 소프트웨어로 내보내어 분석되며, 이 경우 Cambridge Electronic Design의 스파이크 2입니다.

우리는 사용자 정의 서면 스크립트를 사용하여 ROI 강도 값과 멤브레인 전위의 해당 변화를 플롯하고, 배경 ROI에서 얻은 배경 신호를 빼고 표시된 방정식으로 상대적 변화를 계산하여 칼슘 신호의 변화를 정량화합니다. F zero는 자극 직전의 형광이고 F는 자극 직전의 형광입니다. 여기에서 우리는 확인된 뉴런 B 21에서 칼슘 형광의 변화를 이미지화한 실험 결과를 보여줍니다.

우리가 이미지화한 영역은 A에서 표시되고, B 1에서는 B 21에서 스파이크의 폭발을 유도했으며, 이는 B 8에서 시냅스후 전위와 칼슘 신호의 변화를 유도했습니다. B 2는 칼슘 킬레이터 주입의 효과를 보여줍니다. B 21의 EGTA 스파이크는 더 이상 칼슘 형광의 광범위한 증가를 유도하지 않으며 시냅스 후 전위 진폭이 감소합니다.

결론적으로, 우리는 세포 내 칼슘 농도를 동시에 모니터링하고 시냅스 전달의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있는 기술을 입증했습니다. 이러한 기술은 대부분의 기능적 이미징에 비해 적당한 장비만 필요하며 쉽고 빠르게 배울 수 있습니다.