טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ LPS מחיידקים גרם שליליים. זה מושג על ידי גידול תרבית לילה של חמישה מיליליטר של חיידקים במדיום מתאים והתאמת התרבית לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.5. לאחר מכן, החיידקים עוברים כדורים על ידי מיקרו צנטריפוגה והתאים מושעים מחדש במאגר טריס המכיל SDS ואתנול קרן או קפטו.

לאחר מכן מרתיחים את הליזטים של התאים ומטפלים בפרוטאז ונוקלאז. לבסוף, שתי מיצוי עוקב מתבצעות עם פנול מימי חם ואתר דיל מסירים בזהירות ושומרים על השכבה הכחולה המימית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כמות כמו גם נוכחות או היעדר LPS וזני חיידקים, כמו גם אופן אורך שרשרת אנטיגן O באמצעות הפרדה על ידי דף SDS וניתוחי דם מערביים עם נוגדנים ספציפיים ל-LPS או צביעה ישירה של הפוליסכרידים בג'ל.

היתרון של טכניקה זו בהשוואה לטיפול בפרוטאז של היצ'קוק ובראון הוא שטכניקה זו מובילה לדגימות LPS טהורות שניתן לפתור טוב יותר על ידי דף SDS וכתמים מערביים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הסינתזה והוויסות של ליפופוליסכריד ב-VIR כמעט לכל חיידק גרם שלילי, כולל אי קולי וסלמונלה, כמו גם הגנה ביולוגית ופתוגנים מתפתחים כגון אלה ואצטובקטר בהתאמה לגידול חיידקים. למיצוי LPS, הגדר תרבית לילה של חיידקים גרם שליליים בחמישה מיליליטר LB בתוספת אנטיביוטיקה.

במידת הצורך, גדלו את התרבות למשך הלילה בחממה רועדת בטמפרטורה של 200 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס. השתמש ב-LB כדי לדלל את התרבית מאחד עד 10, ולאחר מכן מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר על סמך התוצאה. הכן תרחיף של 1.5 מיליליטר של החיידקים עם צפיפות אופטית סופית ב -600 ננומטר של 0.5.

גלולה את החיידקים במיקרו צנטריפוגה ב 10, 600 פעמים G למשך 10 דקות. לאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטנט. כדי לחלץ LPS הכינו את הפתרונות הבאים, מאגר XSDS אחד, 4% betta me capto ethanol או BME 4% SDS, ו-20% גליצרול ב-0.1 טריס HCL מולארי pH 6.8 עם קמצוץ ברומו פנול כחול ו-10 מיליגרם למיליליטר תמיסות של DNA RNA אחד ופרוטאינאז K במים מזוקקים סטריליים מושעים מחדש.

החיידקים הגלולים ב-200 מיקרוליטר של מאגר XSDS אחד מבטיחים שהגלולה מושעה לחלוטין על ידי פיפטינג של התמיסה למעלה ולמטה. הרתיחו לאט את החיידקים התלויים באמבט מים למשך 15 דקות. לאחר מכן הניחו לתמיסה להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

כצעד אופציונלי, הוסף חמישה מיקרוליטר מכל אחת מתמיסות ה-DNA וה-RNA ודגירה על הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מוסיפים 10 מיקרוליטר מתמיסת הפרוטאז K ודוגרים את הדגימות בטמפרטורה של 59 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. ליד כל דגימה מוסיפים 200 מיקרוליטר טריס קר כקרח, פנול רווי.

סגור היטב את המכסים ומערבל כל צינור למשך חמש עד 10 שניות. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מערבולת, מדי פעם לקרר אותם לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן מתחת למכסה אדים, הוסף מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר, אתיל אתר לכל דגימה ומערבולת למשך חמש עד 10 שניות. צנטריפוגה את הדגימות ב 20, 600 פעמים G למשך 10 דקות והסר אותן בזהירות מהצנטריפוגה. חלץ את השכבה הכחולה התחתונה מכל דגימה, הימנע מהשכבה השקופה העליונה.

הוסף עוד 200 מיקרוליטר של טריס קר כקרח, פנול רווי, וחזור על המיצוי לכל צינור. הוסף 200 מיקרוליטר של שני מאגר XSDS. הפרד חמישה עד 15 מיקרוליטר מכל דגימת LPS על שמונה עד 15% ג'לים פולי אקרילאמיד SDS.

מוצג כאן ג'ל עמוד 12% SDS של דגימות LPS שהוכנו מזנים שונים של אזור קר דה לוסה, מבודדים מדגימות ליחה של חולי סיסטיק פיברוזיס. דפוסי הפסים השונים משקפים את המספרים השונים של אנטיגן O, יחידות חוזרות המחוברות לאוליגוסכרידים הליבה. ניתן לראות מספר דומה של יחידות חוזרות בדגימות 1 ו-6.

אל תשכח שעבודה עם אתר פנול דתיל עלולה להיות מסוכנת באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי כגון מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן, ויש לבצע ניסויים אלה במכסה אדים בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לבצע את החילוץ במהירות כדי שלא תאבד את הדגימות במהלך העיבוד. לאחר הליך זה, יש לנקוט בכתמים חיסוניים מערביים או שיטות להמחשת פוליסכריד הליפו על ידי STR כסף או שיטות אחרות על מנת לדמיין את הקשר בין הזנים.