Name: 소설 허벌 요법을 평가하는 패혈증의 동물 모델의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 배우세요 췌장 결찰 및 천공 수술을 이용하여 패혈증 마우스 모델을 만드는 방법을. 이 기법은 약용 허브의 치료 효능을 평가하고 염증 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 보건원, 국립 일반 의학 과학 (R01GM063075)의 연구소 보완 및 대체 의학의 국립 센터 (R01AT05076)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 패혈증의 동물 모델의 확립 <ol><li> 마우스는 케타민 (75 밀리그램 / kg, 근육내, IM) 및 xylazine (10 밀리그램 / kg, IM)와 anesthetized하며, 나태한 자리에 서있는. </li><li> 안정적인 지위를 보장하기 위해 테이프로 마우스의 발을 고쳐. </li><li> betadine이나 기타 피부 소독제 및 알코올 3 교대 스크럽으로 복부를 청소합니다. 다음 15 밀리미터 중간선 절개는이게 맹장을 폭로합니다. </li><li> 대변​​의 압출 수 있도록 22 게이지 바늘로 한 번 출혈도 잡았 cecal 몸통 cecal 끝부분에서 약 5.0 mm에서 4-0 실크 봉합사로이게 맹장을 Ligate 후 펑크. </li><li> 이게 맹장은 즉시 정상 내부 복부 위치로 다시 바뀝니다. </li><li> 첫째 흡수성 봉합과 복부의 근육을 폐쇄하고 상처 클립이나 nonabsorbable 봉합과 피부를 닫아 두 레이어에 절개 사이트를 닫습니다. </li><li> 0.5 ML 정상적인 생리 식염수로 마우스를 소생과 단일 할즉시 수술의 완료 후 imipenem의 SE (subcutaneously 0.5 밀리그램 / 마우스). </li><li> 음식과 물을 무료로 이용 깨끗한 새장에 다시 마우스를 반환합니다. </li><li> 다양한 시간 포인트 포스트 CLP에서 허브 추출물 또는 구성 요소 intraperitoneally을 관리합니다. </li><li> 동물의 생존은 세 개 이상의 주 동안 감시하고 있습니다. 서서하는 어려움, 사망 전 호흡, 심한 근육 위축 및 통제 출혈을 전시 죽어가는 동물은 과다 복용 이산화탄소 흡입으로 euthanized해야합니다. </li><li> 그것은 시토킨 수준을 순환하는 것은 이러한 연구에 중요한 파라미터 점에 유의하는 것이 중요합니다. 각종 진통제는 시토킨 릴리스와 활동에 영향을 표시했습니다, 따라서 의도적으로 수술 후 치료를 피할 수있다. </li></ol> 2. 허벌 추출의 작성 <ol><li> 1-4 시간 (나뭇잎을위한 1 시간, 그리고 뿌리를위한 4 시간)에 대해 뜨거운 물 (85 ​​° C)의 허브를 추출합니다. </li><li> 물 정도 원심 분리기luble 분수 (3,300그램, 20 분, 4 ℃) 불용성 입자를 제거합니다. </li><li> 여과액 0.2 μm의 필터를 통해 뜨는 분수. </li><li> 맑은 수용성 여과물 분율 다음 Centriprep YM-10 원심 필터 (카탈로그 안돼. 4,305, Millipore)를 사용하여 ultrafiltration fractionated입니다. </li><li> 은 (&lt;10 kDa와 높은 (10 kDa) 낮은)&gt; 분자량의 분수 (MWF)는 대식 세포 문화를 사용하는 HMGB1-억제 활동을 심사하고 결과. </li><li> 24 시간 포스트 CLP에서 HMGB1-억제 허브 추출물 또는 구성 요소의 Intraperitoneal 행정부는 그들의 치료 효능을 평가합니다. </li></ol> 3. 복막 대식 세포 격리 <ol><li> Thioglycollat​​e 국물 (4 %, 2.0 ML)는 정상 생쥐에 intraperitoneally을 관리합니다. </li><li> 기본 복막 macrophages는 이전에 10의 설명에 따라 3 일 수확하고 있습니다. </li><li> Macrophages 1과 보충 DMEM 배지 (Gibco BRL, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)에서 사전 교양입니다0% 태아 소 혈청 (FBS), 2 mmol / L 글루타민, 그리고 1퍼센트 페니실린. </li><li> 자기편 macrophages는 가볍게에서 함께 씻어과 교양되며, 혈청 프리 이시간 박테리아 내독소로 자극하기 전에 OPTI-MEM 나는 매체 (lipopolysaccharide, LPS, E. 대장균 0111 : B4, 시그마 - 올드 리치). </li><li> LPS의 자극 후 16시간에서 문화 매체에서 HMGB1의 수준은 서양의 모래 바닥은 분석 11 시까지 결정됩니다. </li><li> 상대 밴드 강도가 HMGB1 투석을 함께 생성되는 표준 곡선에 대한 참조로 HMGB1 수준을 결정하기 위해 NIH 이미지에게 1.59 소프트웨어를 사용하여 계량되었다. </li></ol> 4. 대표 결과 1. CLP은 조직과 지역 염증을 유도합니다. CLP 수술 몇 시간 내에 동물 piloerection, 혼수, huddling, 그리고 음식과 물을 섭취의 감소를 포함 패혈증의 임상 증상을 보이기. 연속 체계적으로 심한 복막염을 개발하는 동물96 HR - 감염은 일반적으로 48 이내에 죽어. 그러나, 심지어는 나이, 성별 -, 그리고 유전적 배경 - 유사한 동물 실험 패혈증의 과정에서 특이한 방식으로 수술을 CLP에 응답할 수 있습니다. 어떤 동물이 죽어가는 상태 (그림 1에 정의된) 접근했을 수도 있지만 예를 들어, 48 시간 포스트 CLP에서, 다른 사람이 아닌 죽어가는 상태에서 남아있을 수 있습니다. 순환 크린 시토킨의 종합 설문 조사는 죽어가는가 아닌 죽어가는 상태 (그림 1) 12의 생쥐간에 여러 크린 시토킨 수준의 극적인 차이 (예, IL-6, KC, MIP-2 및 sTNFR1)을 공개했다. 그들의 순환 수준 실험 또는 임상 12-14 패혈증 15 치명적인 결과의 신뢰성 predictors이기 때문에 특히, 이러한 염증 중재자는 패혈증의 대리 마커로 분류되었습니다. 또한, CLP는 또한 다양한 프로와 안티 - 염증 크린 시토킨 및 chemokines의 지역 릴리스를 유도. 에서, 예를 들어48 시간 포스트 CLP, 중요한 크린 시토킨의 금액 (예, IL-6)과 chemokines은 (KC와 MIP-2) 아직 또한 로컬 복막 세척 유체 (그림 2) 혈액뿐만 아니라 systemically 측정하지만 수 있습니다. 2. HMGB1-억제 허브 추출물 또는 구성 요소에 대한 심사. 대식 세포 배양을 사용하여, 우리는 억제 내독소 - 유도된 HMGB1 자료의 다양한 허브 추출물 또는 구성 요소의 용량 (그림 3)을 평가할 수 있었다. 억제 HMGB1 자료들의 능력에 비추어, 우리는 더 이상 동물 모델 패혈증에 그들의 효능을 탐험. 시점 쥐가 혼수, 설사, 그리고 piloerection 포함한 패혈증의 명백한 징후를 개발 - 실험적 패혈증 8 HMGB1 축적의 후반과 연장 속도론을 감안할 때, HMGB1 억제제의 처음 복용량은 패혈증의 발병 후 24 시간이 주어졌다. 마찬가지로 그림 4에 표시된 지연 및 주요 녹차 광고의 반복 관리omponent, epigallocatechin-3-gallate (EGCG)가 패혈증의 발병 후 24 H 시작하여 상당히 치명적인 패혈증 12 쥐를 구출. 구두로 주어진 경우에도 크게 16 % 아래로 44% 16 일부터 동물의 생존 속도를 증가, 치명적인 패혈증에서 여전히 구출 쥐를 EGCG. 그것은 여러 허브 구성 요소를 사용하여 조합 요법이 패혈증의 동물 모델에서 상당한 더 나은 보호를 달성할 수 있는지 여부를 확인하는 것이 중요 것입니다. 함께 촬영 이러한 실험 데이터는 CLP-유도된 패혈증의 동물 모델을 사용하여 화면에 소설 치료 중개사에게 우리의 접근 방식을 검증. 5. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig1.jpg" /> 1 그림. 대리모 마커의 순환 수준은 죽어가는 상태에 접근 패혈증에 의한 동물에 극적으로 높아집니다. Balb / C 마우스는 CLP에 의해 패혈증 들어서는과 질병의 징후의 발전을 위해 감시되었다. 에서패혈증 (52 HR 게시물 CLP)의 늦은 단계는 혈액 3 정상 생쥐 (-CLP), 죽어가는 상태를 접근 3 정화조 마우스, 그리고 비 죽어가는 상태에서 3 패혈증에 의한 생쥐로부터 수집되었다. 세럼은 각 그룹에서 풀링하고, 항체 어레이에 의​​한 시토킨 프로필 assayed되었다. 서로 다른 그룹 간의 여러 대리모 마커의 상대적인 수준의 극적인 차이를 확인합니다. 제작사로부터 부여된 허가 10.1371/journal.pone.0001153.g006 : 간접 자원부에서 적응. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig2.jpg" /> 그림 2. 48 시간 포스트 CLP. Balb / C 마우스에서 로컬 및 체계적 크린 시토킨 및 chemokines의 감지는 CLP에 의해 패혈증를 받게되었으며, 혈액 또는 복막 액은 48 H 포스트 CLP에서 수확했다. 여러 크린 시토킨 및 풀링된 혈청이나 복막 세척 유체의 chemokines의 상대적 수준은 시토킨 항체 어레이로 측정하고, 임의의 단위 (AU)으로 표현되었다. 컨트롤, 혈액 및 복막 유체 SA로mples은 개복술없이 정상적인 건강한 동물 (-CLP)에서 얻은되었다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig3.jpg" /> 그림 3. 허벌 구성 요소는 선량 - dependently 기본 대식 세포 배양에서 내독소 - 유도된 HMGB1 릴리스를 저해. 차 murine 복막 macrophages는 부재의 LPS, 또는 한방 구성 요소의 존재 (예, EGCG, 15 μm의)을 자극했다. LPS의 자극 후 16시간에서 문화 매체에서 HMGB1의 수준은 서양의 모래 바닥 분석에 의해 결정됩니다. 제작사로부터 부여된 허가 10.1371/journal.pone.0001153.g006 : 간접 자원부에서 적응. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig4.jpg" /> 4 그림. 허벌 구성 요소가 Balb / C 마우스는 CLP에 의해 치명적인 패혈증를 받게되었다. 치명적인 패혈증에서 마우스를 구출하고, 한방 성분 (EGCG)가 24에서 시행 intraperitoneally 있었는데, 48, 72시간는 패혈증의 발병을 게시할 수 있습니다.imal 생존는 2 주 동안 감시했다. 카플란 - 마이어 방법은 그룹 간의 사망률 속도의 차이를 비교하기 위해 사용되었다. *, P &lt;0.05 염분 대. 제작사로부터 부여된 허가 10.1371/journal.pone.0001153.g006 : 간접 자원부에서 적응.

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AES와 HW는 패혈증에 대한 잠재적인 치료 대리인으로서 HMGB1 억제제 (tanshinones) 관련 특허 출원의 공동 발명가입니다.

실험실에서는 패혈증의 여러 동물 모델은 잠재적인 소설 요법을 개발하기 위해서는 패혈증의 pathogenesis을 이해하는 고용되었습니다. 그들의 임상적 관련 성은 패혈증에 대한 임상 응용에 대한 동물 연구의 성공적인 번역을하기 전에 논쟁의 대상이 남아있다. 조기 크린 시토킨에 대한 중화 항체 (예 : TNF)는 bacteremia / endotoxemia 17,18의 동물 모델에서 보호했지만, 그들은 실제로 패혈증 19 동물 모델에서 생존을 악화. 마찬가지로, 대부분의 안티 TNF 요원들이 20-22 패혈증의 임상 실험에서 효능을 표시하는 데 실패했습니다. 이 실패는 부분적으로 패혈증 23,24의 기본 병원성 메커니즘의 복잡성에 반영합니다. 또한, 그것은 또한의 선택에 함정의 귀책들 : 1) 가능한 치료 대상이나 약물, 2) 최적의 복용과 약물의 타이밍, 그리고 3) 비 현실적인 임상 결과 조치 (예 : 사망률 속도 등) 25. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 퍼듀 제품 LP </td><td> 25655-41-8 </td></tr><tr><td> imipenem </td><td> 머크 &amp; 유한 주식 회사 </td><td> 9,882,821 </td></tr><tr><td> 케타민을 HCL </td><td> Hospira 주식 회사 </td><td> RL-0065 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 로이드 연구소 </td><td> 4821 </td></tr><tr><td> Autoclip </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 427,631 </td></tr><tr><td> 4-0 실크 봉합사 </td><td> Roboz </td><td> SUT-15-2 </td></tr><tr><td> Surflo IV 카테터 </td><td> Terumo </td><td> SR * OX2419CA </td></tr><tr><td> RayBio 마우스 시토킨 항체 어레이 </td><td> RayBiotech 주식 회사 </td><td> AAM-CYT-3 </td></tr><tr><td> Thioglycollat​​e </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 211,716 </td></tr></tbody></table>

소설 허벌 요법을 평가하는 패혈증의 동물 모델의 사용

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

패혈증은 미생물 감염으로 인한 전신 염증 반응 증후군을 말합니다. 그것은 외인성 세균 독소 (endotoxemia) 또는 박테리아 (bacteremia)의 주입뿐만 아니라 cecal 내고 주사 (CLP) 1-3 의해이게 맹장의 수술 천공 등 여러 가지 기법에 의해 동물에서 정기적으로 모의하고있다. CLP는 다공 맹장염 또는 diverticulitis의 인간 임상 질환을 흉내낸, 박테리아의 spillage 및 복막 캐비티의 배설물로 오염 수 있습니다. 같은 최종 사망률 속도에 의해 반영 패혈증의 심각도는, cecal 찔린 2 사용 바늘의 크기를 변화하여 수술 제어할 수 있습니다. 인간의 패혈증 3의 임상 과정 동안 지켜봤을 때 동물에서는 CLP는 심장 혈관 신진 대사와 면역 반응과 유사, biphasic hemodynamic을 유도합니다. 따라서 CLP 모델은 1-3 실험적인 패혈증에 가장 임상적으로 관련성이 높은 모델 중 하나로 간주됩니다. &lt;이/ P&gt; 다양한 동물 모델 실험적인 패혈증의 pathogenesis의 기본 복잡한 메커니즘을 명료하게하다하는 데 사용되었습니다. 패혈증의 치명적인 결과가 조기 크린 시토킨의 과도한 축적 4-6과 늦은 전염증성 중재자 (예 : HMGB1) 7 (예 : TNF, IL-1과 IFN-γ 등)에 부분적으로 기인 것입니다. 초기 전염증성 크린 시토킨와 비교할 때, 늦게 연기 중재자는 임상 애플 리케이션을위한 광범위한 치료 창이 있습니다. 예를 들어, CLP 후 24 시간을 시작 HMGB1 - 중화 항체의 지연 행정부는 여전히 치명적인 패혈증의 늦은 중재자로 HMGB1를 설립, 주죠 8,9에서 쥐를 구출. 늦은 연기 중재자로서 HMGB1의 발견 중국어 허벌 의학을 사용하여 패혈증 요법의 발전을위한 조사의 새로운 분야를 시작했습니다. 본 논문에서 우리는 HM에 대한 한방 의학을 심사한에서 CLP 유도된 패혈증의 절차를 설명하며 사용치료를 GB1 타겟팅.

패혈증은 미생물 감염으로 인한 전신 염증 반응 증후군을 참조하고, cecal 내고 주사 (CLP)을 되나 수술 기법에 의한 시뮬레이션이 될 수 있습니다. 여기 치료 대리인을위한 약초를 구분할 CLP 유발 동물 모델을 사용하는 방법을 설명합니다.

패혈증은 미생물 감염으로 인해 발생하는 전신성 염증 반응 증후군을 의미합니다. 이는 여러 가지... 방법을 통해 동물 모델에서 일상적으로 모사되어 왔습니다.

이 절차의 전반적인 목적은 CLP(Cecal Ligation and Puncture, 맹장 결찰 및 천공)라고 불리는 외과적 수술을 통해 패혈증 마우스 모델을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 복부에 1.5~2cm의 정중선 절개를 가함으로써 수행됩니다. 다음으로, 맹장을 노출시켜 결찰한 후, 맹장을 천공하여 박테리아 전이를 유도합니다.마지막으로, 절개 부위를 봉합합니다. 결과적으로 전신 및 복강 내 사이토카인 수치의 증가뿐만 아니라 무기력증 및 사망률과 같은 증상이 나타나는 결과를 얻을 수 있습니다. 이제 제가 보여드릴 내용은 Dr. Chandry와 공동 연구진이 개발한 기존 모델을 수정한, Cecal ligation and puncture라고 불리는 마우스 패혈증 모델을 제작하는 방법입니다.이 모델의 주요 장점은 패혈증의 가장 관련성 높은 모델이라는 점입니다. 또한, 단순하고 특성이 잘 규명되어 있으며 경제적으로 실현 가능하므로, 패혈증 및 염증 연구 분야에서 널리 사용되어 왔습니다. 예시로서, 패혈증에서 식물 추출물의 치료 잠재력을 평가하기 위해 이 모델을 활용하는 방법을 시연하겠습니다.허브 추출물을 준비하려면, 불용성 입자를 제거하기 위해 10 g의 허브를 85 °C의 물 200 mL에 1~4시간 동안 담근 후, 수층 분획을 4 °C에서 3,300 G로 20분간 원심분리합니다. 그다음, 상층액을 0.2 µm 필터로 여과합니다. 이어서 10,000 kDa 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)의 원심분리 필터를 사용하여 4 °C에서 5,000 G로 60분간 회전시켜 여과액을 추가로 농축합니다.대식세포 배양물을 사용하여 high mobility group box one 또는 HGB one과 같은 후기 염증성 매개체의 억제 활성에 대해 저분자량 및 고분자량 분획을 스크리닝하였습니다. 대식세포 분리를 시작하기 위해, 먼저 일반 마우스의 복강 내에 4% TH glycol broth 2 mL를 투여하고 3일 후 일차 복강 대식세포를 수확하여 10% FBS, 2 mM glutamine 및 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM에서 배양하였습니다. 부착된 대식세포를 optimum으로 부드럽게 세척한 후 동일한 배지에서 2시간 동안 배양하였습니다.그 후, 자극 16시간 뒤에 세균 내독소인 lipopolysaccharide 또는 LPS로 세포를 자극합니다. 세포 배양 상층액

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간 패혈증 연구에 유용한 도구로 cecal 내고 주사의 마우스 모델입니다.

Cecal 내고의 찔린 절차

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위독한 병의 마우스 모델에서 유체, 약물 및 영양 관리를위한 중심 정맥 라인의 사용

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세칼 결찰 및 천자 및 비강 내 감염 이중 모델 패혈증 유발 면역 억제 설계

여기에서, 우리는 쥐에서 재현 가능한 중환자 실 지향 내독소 모델을 제시한다.

쥐의 재현 가능한 집중 치료실 지향 내독소 모델

이 프로토콜은 패혈증의 마우스 모델에서 맹장 결찰 및 천자 (CLP)의 수술 세부 사항을 제시합니다. CLP는 패혈증의 동물 모델을 만들기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 따라서 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻으려면 표준화된 CLP 프로토콜이 필요합니다.

패혈증의 맹장 결찰 및 천자 유도 마우스 모델에서 신뢰할 수 있는 바이오마커의 평가

이 프로토콜은 골육종 마우스 모델의 Yiqi Jiedu 달인을 예로 들어 달인 공식 및 gavage 기술의 자세한 표준화 프로세스를 제공합니다. 동물 보호에 대해 설명하고 연구 데이터의 신뢰성을 개선하여 생체 내 달인 공식의 치료 효능 및 분자 메커니즘을 조사하기 위한 효과적인 전략을 제공합니다.

골육종 모델 마우스에서 중국 전통 의학의 달인 공식에 대한 Gavage 전략

수술 스트레스의 마우스 종양 모델은 수술 후 면역 억제는 전이성 질환을 촉진하는 방법을 탐구하고 면역 수술 요법을 평가하는 데 사용됩니다.

수술 후 면역 억제의 메커니즘을 탐색 소설 수술 전후 면역 요법을 평가하기 위해 수술 스트레스의 마우스 종양 모델

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쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

배우세요 췌장 결찰 및 천공 수술을 이용하여 패혈증 마우스 모델을 만드는 방법을. 이 기법은 약용 허브의 치료 효능을 평가하고 염증 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

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