쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 혈청이 없는 상태에서 피질 또는 해마 뉴런을 분리하고 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐 배아를 해부하여 피질 또는 하마 campi를 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 부드러운 효소 소화를 위해 트립 르 익스프레스로 뇌 조직을 배양하는 것입니다.

다음으로, 조직은 동면 E와 기계적으로 분쇄되고 완전한 배양 배지로 헹궈집니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 마지막 단계는 poly de lysine 코팅 접시 또는 poly de lysine, laminin 코팅 유리 슬라이드에서 해리된 뉴런을 계수하고 플레이트팅하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 신경교세포(glial support) 없이 혈청이 없는 상태에서 뉴런을 격리하고 배양할 수 있습니다.

신경 세포 배양은 면역화학, 핵산, 준비 및 전기 생리학에 사용할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 트립신을 더 부드러운 효소로 대체했다는 것입니다. 우리는 효소 분해 전 조직의 수단과 DN a의 치료법 사용을 생략했습니다.

또한 해부된 코르테스 또는 하마는 해리되기 전에 최대 일주일 동안 4도의 동면 매체에 보관할 수 있습니다. PDL 용액을 먼저 준비하려면 PDL 5mg에 5ml의 멸균 이중 증류수를 첨가하여 1ml/ml의 원액을 얻습니다. 원액을 여러 번 피펫팅하여 혼합한 다음 즉시 사용하거나 섭씨 2-8도에서 보관하십시오.

문화 접시를 코팅합니다. PDL 원액을 멸균 이중 증류수로 최종 농도인 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석합니다. 다음으로 3 밀리리터 용액을 60mm 접시에 피펫팅하여 배양 표면적을 덮습니다.

그 후, 배양 표면이 균일하게 코팅되도록 접시를 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 밤새 배양하십시오. 다음 날에는 흡인에 의해 PDL 용액을 제거합니다.

간단히 말해서, 3ml의 멸균 이중 증류수로 접시를 두 번 씻습니다. 두 번째 세척 후 흡인으로 물을 완전히 제거하십시오. 이 절차에서는 1밀리리터당 1밀리그램의 PDL 원액과 밀리리터당 1밀리그램의 라미네이트 원액을 멸균 이중 증류수에 각각 10 및 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 혼합합니다.

다음으로, 배양 표면을 덮을 수 있도록 유리 2 챔버 슬라이드의 웰에 충분한 용액을 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 챔버를 부드럽게 흔들어 균일한 코팅을 보장합니다. 그 후, 코팅된 접시를 실온에서 밤새 배양합니다.

다음날, 흡인에 의해 PDL 라미네이트 코팅 용액을 제거하십시오. 간단히 말해서, 두 번째 세척 후 1ml의 멸균 이중 증류수로 접시를 두 번 씻으십시오. 이 단계에서 흡인에 의해 물을 완전히 제거하고, 따뜻한 트립 LE 익스프레스 및 뉴로 기저 B 27, 섭씨 37도의 수조에서 완전한 매체를 제거합니다.

그런 다음 4 개의 60mm 배양 접시 각각에 3 밀리리터의 냉 동면 E 용액을 추가하고 13 밀리리터를 15 밀리리터 BD Falcon High clarity 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 추가합니다. 그 후, 3개의 100mm 배양 접시 각각에 25-30ml의 냉해부 배지를 첨가하여 양막에서 배아를 제거한 직후 배아를 세척합니다. 다음으로, E 17 시간이 지정된 임신한 쥐를 희생하고 하복부에 70% 에탄올을 뿌립니다.

그런 다음 가위로 피부와 근육을 중간 정도로 자릅니다. 자궁과 배아를 노출시키려면 모든 태아를 제거하고 과도한 냉 박리가 들어있는 멸균 100mm 접시에 넣으십시오. 매체는 앞서 준비했습니다.

그런 다음 작은 가위를 사용하여 양수에서 배아를 잘라냅니다. 그런 다음 차가운 해부 매체가 들어있는 두 번째 100mm 접시에 넣습니다. 접시를 5-10초 동안 부드럽게 기울여 실온에서 배아를 씻습니다.

그 후, 헹궈진 배아를 해부 매체가 들어 있는 세 번째 100mm 접시에 옮기십시오.실체 현미경으로 한 쌍의 구부러진 집게로 피부와 두개골을 당겨 각 쥐 배아의 뇌를 추출합니다. 차가운 동면 E.와 함께 60mm 접시에 약 5 개의 뇌를 놓고 접시를 얼음에 보관하십시오. 해부 현미경으로 한 번에 한 접시씩 섭취합니다.

반구를 분리하고 대뇌 피질을 분리하십시오. 그런 다음 중뇌와 수막을 제거합니다. 13ml의 차가운 동면이 들어 있는 15ml의 투명한 원뿔형 튜브에 절개된 모든 피질을 수집합니다.

E. 모든 해부가 완료될 때까지 대뇌 피질을 얼음 위에 두십시오. 튜브를 조직 배양 후드로 옮깁니다. 그런 다음 피질이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 위층을 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 13ml의 신선한 동면 E를 15ml 원뿔형 튜브에 추가합니다. 피질이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다시 이 절차를 두 번 더 반복하고 마지막 세척 후 모든 매체를 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 1-2ml의 따뜻한 트립 르 익스프레스를 첨가하여 대뇌 피질을 소화시킵니다. 파라폼으로 튜브의 캡을 밀봉하십시오. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 넣습니다.

그런 다음 튜브에 70% 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 최대 절전 모드 E.Allow 피질이 튜브의 바닥에 정착하고 상층액을 제거하도록 10 밀리리터를 추가하십시오. 이 단계를 세 번 반복하여 여행 Le express를 씻어냅니다.

그리고 마지막 단계에서 모든 미디어를 조심스럽게 제거합니다. 부드럽게 대뇌 피질을 약 4-5 회 신경 기저 B 27 완전한 배지의 2 밀리리터에 삼중 화하십시오. 불에 닦인 유리 목초지를 사용하여 파스퇴르는 더 작은 직경의 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 피질을 4-5번 더 분쇄합니다.

그런 다음 나머지 조직 조각이 가라앉도록 합니다. 그 후, 상부 단세포 현탁액을 침전된 조직 조각을 남기고 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 neuro basal B 27로 세포 현탁액을 최대 10-12 밀리리터까지 추가로 희석하고, 계수를 위해 세포를 희석하는 완전한 배지를 만듭니다.

1.5 밀리리터 엔드 튜브 플레이트에 490 마이크로리터의 50 x 계수 용액에 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. PDL에 세포는 50의 조밀도, 평방 센티미터 당 000의 세포에 판을 입혔다. 뉴런은 시험관 내에서 4-5일 후에 실험에 사용할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 P max GFP와 빨간색 맵 2 항체로 표지된 면역의 영향을 받는 피질 뉴런 핵의 대표적인 이미지입니다. 그리고 다음은 배아에서 원래 해부 된 후 동면 E 플러스 B 27에서 일주일 동안 섭씨 4도에서 유지되었던 피질에서 분리 된 쥐 피질 뉴런의 5 일간의 시험관 배양을 보여줍니다. 뉴런은 앞서 설명한 바와 같이 PDL과 라미닌으로 코팅된 유리 2챔버 슬라이드에 도금되었습니다.

녹색 면역형광은 신경 돌기에서 맵 2의 발현을 나타내고 세포핵은 파란색으로 표시됩니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 혈청이 없고 앵글리아가 없는 조건에서 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.