Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Bu prosedürün genel amacı, DNA vektör tabanlı RNA girişiminin kullanılması yoluyla gen fonksiyonunu belirlemektir. Bu, önce belirli genleri hedefleyen S-H-R-N-A yapılarının tasarlanması ve üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, SH RNA ekspresyon kasetini taşıyan lentivirüsün üretilmesidir.

Daha sonra, hücrelerin lentivirüs ile enfekte edilmesiyle kararlı hücre hatları üretilir ve lentivirüs ile enfekte olmuş hücreler, ilgilenilen genin susturulmasının etkilerini belirlemek için çeşitli in vitro ve in vivo deneylerde kullanılır. Sonuç olarak, kullanılan tahlillere bağlı olarak, sonuçlar, in vitro proliferasyon, göç ve invazyon testlerinin yanı sıra in vivo ksenogreft oluşum modellerinin kullanılması yoluyla gen yıkımının bir sonucu olarak hücrelerin tümör genliğindeki değişiklikleri gösterebilir. Prosedürü gösteren Daniel Stowell, ma Juan olacak ve Daniel laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi, Ma Ma bir teknisyen.

Chang, doktora sonrası bir araştırmacıdır. Bu yöntem, belirli bir genin kanser gelişimi ve ilerlemesinde bir rolü olup olmadığı ve bu süreçlerin hangi yönleri için önemli olabileceği gibi kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Açıklanan kriterlere göre oligonükleotidleri tasarlamaya ve sıralamaya başlamak için, hedef gende 20 ila 23 nükleotid hedef dizisini içeren iki ters tamamlayıcı oligo olan Anil.

İki uçta eko R bir ve Hintçe üç site oluşturacaklar. Diz çöktükten sonra, başka bir oligo, hedef diziye ters tamamlayıcı bir dizi ve onun üç asal ucunu içerir. Bir yukarı akış astarı ile H bir veya U altı promotörün üç ana ucuna Neils.

Her iki ucunda BAM H bir ve Hintçe üç site bulunan bir parça oluşturmak için bir PCR kullanın. Bu arada, lentivirüs vektörünü ve PCR fragmanını sindirin. Daha sonra vektör, PCR fragmanı ve Anil oligo nükleotidleri arasında üç parçalı bir ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin.

Bir ila 10 ila 10 molar oranında, ortaya çıkan vektör, döngü bölgesinde bir Hintçe üç dizi ile ilgilenilen HRNA'yı üretecektir. İndüklenebilir bir vektör kullanılırsa, HRNA üretimi, sistemdeki Tet için doksisiklin gibi bir indükleyici molekülün varlığına bağlı olacaktır. Şimdi bağlanmış ürünü kullanarak yüksek verimli, yetkin e coli DH beş alfa hücresini dönüştürün ve koloni bazlı bir PCR ekranı kullanarak pozitif vektörleri tanımlayın.

Vektörü ve indüklenebilir promotör ligasyon bölgesini kapsayan bir ürünü yükseltin. Ticari bir kit ile pozitif kolonilerden plazma DNA'sı hazırlayın. Daha sonra ekin varlığını BAM H one ve ECO R one sindirimi ve DNA agaroz elektroforezi ile onaylayın.

Ek olarak, LIGA nükleotid P beş kullanarak promotörü ve SHRNA'yı içeren bölgeyi sıralayın. Endotoksin içermeyen bir MIDI veya maksi hazırlık kiti kullanarak, HRNA ekspresyon kasetini taşıyan lentivirüs DNA'sını hazırlayın. 260 nanometrede ışık emilimini ölçerek DNA konsantrasyonunu belirleyin ve 260 ila 280 nanometre ışık absorpsiyon oranının 1.8 ile 2.0 arasında olduğunu kontrol ederek DN a'nın saflığını sağlayın.

Son olarak, S kıvrılmış olduğundan emin olmak için lentivirüs plazmidini bir aero jel üzerinde çalıştırın Transfeksiyondan önce, önce 0.9 mililitre A çözeltisini 0.9 mililitre B çözeltisine yavaşça bırakarak ve bir pipetle B çözeltisinden hava köpürterek transfeksiyona hazırlanın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, karışımın 0.6 mililitresini HEK 2 93 T hücreleri ile üç farklı 10 santimetrelik plakaya yavaşça bırakın.

Daha sonra hücreleri dört ila altı saat sonra inkübatöre geri koyun. Ortamı yedi mililitre tam DMEM ortamı ile değiştirin. 24 saat sonra, beş mililitre daha orta ekleyin ve 24 saat sonra, lentivirüs içeren ortamı hasat edin.

Hasat edilen ortamı oda sıcaklığında 1500 RPM'de 10 dakika döndürün. Süpernatanı 0.45 mikrometre filtre kullanarak filtreleyin. Akışı, lentivirüs içeren ortamdan ultra santrifüjleme ile döndürün.

Süpernatanı %5 çamaşır suyu içeren bir atık kabına boşaltın. Lentivirüs peletini yarım ila bir mililitre soğuk bir XPBS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra lentivirüs çözeltisini eksi 80 santigrat derecede saklamak için 50 ila 100 mikrolitrelik alikotlara bölün.

Son olarak, güvenilir bir teknik kullanarak lentivirüsün titresini belirleyin. Tipik olarak, 10 santimetrelik bir kültür kabı, hücre enfeksiyonuna devam etmeden önce 50 ila 100 milyon enfeksiyöz birim üretecektir. Bu prosedür için bir kit veya RTPCR kullanarak lentiviral titrenin MOI'sini belirleyin.

Dörtten düşük bir MOI önerilir. Enfekte olacak hücreleri altı oyuklu bir plakada% 30 ila 40 co akıcılığına tohumlayarak başlayın ve gece boyunca kültürleyin. Ertesi gün.

Ortamı bir mililitre taze, orta içeren poli beyin veya protamin ile değiştirin. Sonra bir ile 2 milyon iu arasında ekleyin. Bir floresan veya bir antibiyotik belirteci içeren bir lentivirüs.

Karıştırmak ve altı saat inkübe etmek için plakayı 10 saniye yavaşça sallayın. Altı saat sonra, ortamı normal, tam ortamla değiştirin ve hücreleri iki gün boyunca çoğaltın. Ortam, iki gün sonra kullanılan lentivirüsten bağımsız olarak antibiyotik veya indükleyici içermemelidir.

Lentivirüs bir antibiyotik belirteci içeriyorsa uygun antibiyotiği ekleyin. Benzer şekilde, lentivirüs indüklenebilirse kültürlerin yarısına indükleyici ekleyin. Hücreleri antibiyotikler ve indükleyicilerle iki veya üç gün daha kültürledikten sonra, ksenogreft tripsin gözlerinden önce hedef genin yıkılmasını test etmek için bir batı kan analizi yapın.

Büyük hücre kültürü kaplarından gelen hücreler ve% 50 matrigel içeren orijinal ortamda yeniden süspanse edilir. Kanser hücresinin yeniden askıya alınması ve% 50 matrigel ve şırınganın buz üzerinde tutulması esastır. Aksi takdirde, matrijelin katılaşması ve enfeksiyonun bu konuda AB'ye başvurması riski vardır.

Ameliyat bölgesini %70 etanol ile iyice temizleyerek hazırlayın ve anesteziyi mükemmel ventilasyon ve indüksiyon odasına bağlı bir isof flor tutucu filtre ile gerçekleştirin. Hücre aşılamasından üç ila beş dakika önce% 1.5 oksijen ile karıştırılmış% 2 flor kullanarak% 2 flor kullanarak timik çıplak fareleri uyuşturun. Daha sonra bir burun konisi aracılığıyla oksijenle karıştırılmış% 2 flor kullanarak anesteziyi sürdürün.

Fareyi 30 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Hücreleri, deri altı enjeksiyonlar için 25 buçuk gauge iğne veya ortotopik enjeksiyonlar için 28 ila 30 gauge iğne ile şırıngalara yükleyin. Bir veya iki bölgede anestezi indüksiyonundan beş dakika sonra, 200 mikrolitre bolusta bir ila 10 milyon hücre enjekte edin.

Hücre sayısı, kanser hücrelerinin malignitesine veya agresifliğine bağlıdır. Yapısal olarak aktif vektörler için, hedef gen S-H-R-N-A veya vektörler üzerinde karıştırılmış bir S-H-R-N-A fortetini eksprese eden hücrelerle enjekte edilen iki grup fare kullanın. Aynı iki grubu kullanın ve her birini sularında indükleyici olan veya olmayan alt gruplara ayırın.

Su içeren belgeleri haftada iki kez değiştirin. Tümörlerin hacmini haftada bir veya iki haftada bir C ile izleyin. Tümör hacminin kurumsal veya A CUC sınırını aşmadığından emin olun ve geniş ülserasyon, nekroz, bariz enfeksiyon, kontrolsüz kanama veya son dönem hastalık gösteren hayvanları ötenazi yapın. Biyolüminesan bir işaretleyici aracılığıyla tümör büyümesini ve metastazı izlemek için, çalışma alanını dezenfekte edin ve fareleri gazlı anestezi ile bir görüntüleme odasında uyuşturun.

İlk olarak, iki ila beş dakikalık bir pozlama yapın ve sinyal yoğunluğunu kontrol edin ve ardından buna göre ayarlayın. Tümör boyutu 1000 milimetreküpü veya kurumsal boyut sınırını aşarsa, kurban üzerine hayvana ötenazi yapın, tümör boyutunu belgeleyin ve daha fazla analiz için saklayın. Bu protokol, neden Y'nin bir knockdown'ın, atemik çıplak farelere implante edilen insan meme adenokarsinomu hücrelerini eksprese eden lusiferazın ksenogreft tümör oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıldı.

İnsan YY'nin S-H-R-N-A hedef dizisi ve bilinen herhangi bir insan transkriptine önemli bir benzerliği olmayan şifreli bir kontrol S-H-R-N-A'nın her ikisi de test edildi. Sonuç olarak, iki lentiviral vektör oluşturuldu ve iki lentivirüs üretmek için kullanıldı. Her ikisi de iki farklı hücre popülasyonunu enfekte etmek için kullanıldı ve poliklonal hücre popülasyonları elde edildi.

Pur misin seçiminden sonra. Batı kan analizi, bu enfekte hücre hatlarında DS'nin neden olduğu YY bir yıkımı doğruladı. Daha sonra, indüklenebilir YY bir S-H-R-N-A ile enfekte olan klon üçünün poliklonal hücre popülasyonu ve kontrol. S-H-R-N-A.

LENTIVIRÜSLER, YY bir tükenmesinin invazyon üzerindeki etkilerini test etmek için kullanıldı. YY bir tükenmenin hücrelerin invazivliğini azalttığını gözlemledik. Batı kan analizi, doktorların indu YY bir S-H-R-N-A ile hücrelerde YY bir susturmayı indüklediğini, oysa kontrol içeren hücrelerin olduğunu doğruladı.

S-H-R-N-A bu etkiyi göstermedi. Bu hücreler daha sonra kontrol gruplarına kıyasla bir ksenogreft fare modeli çalışmasında kullanıldı, YY, su içeren doslarla birlikte verilen bir S-H-R-N-A implante edilmiş fare, biyolüminesans ile görselleştirildiğinde ve tümör ağırlıkları beklendiği gibi ölçüldüğünde tümör oluşumunda önemli ölçüde azalma gösterdi. Bu ksenogreft tümörlerinde bir susturma western blot ile kolayca doğrulandı.

Çalışmalar: NIHB güvenlik hususlarına göre, lentivirüs ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın: lentiviral vektörlerle yapılan araştırmalar için, tüm laboratuvar ortamları için gelişmiş B güvenlik seviyesi iki muhafaza prosedürü gereklidir.