دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج في المختبر لدراسة تجديد محور عصبي للثدييات باستخدام الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية البالغة أو الخلايا العصبية DRG. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح DRGs أولا من الفئران البالغة ، والتي يتم فصلها بعد ذلك إلى خلايا مفردة. ثم يتم نقل الخلايا العصبية المنفصلة عن طريق التثقيب الكهربائي وزراعتها لبضعة أيام للتلاعب وراثيا بتعبيرها الجيني.

الخطوة الأخيرة هي إعادة تعليق الخلايا العصبية وإعادة تأهيلها لثقافة إضافية بين عشية وضحاها. في النهاية ، يتم استخدام تحليل طول المحور العصبي القائم على الفحص المجهري لدراسة إعادة نمو المحاور العصبي من الخلايا العصبية التي تم التلاعب بها وراثيا. الميزة الرئيسية لتعليق إعادة الخلية وتكرار الخطوة المستخدمة في هذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل نمو المحور العصبي من الخلايا العصبية التي تم التلاعب بها وراثيا بالفعل.

هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لفقدان الوظيفة الدراسات التي يتم فيها استخدام نهج RNI لتقليل تنظيم الجين ذي الأهمية الذي يوضح الإجراء سيكون الدكتور سفو ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري. لتحضير زلات غطاء الثقافة العصبية أولا ، قم بغسلها بحمض الهيدروكلوريك بنسبة 10٪ طوال الليل. في اليوم التالي ، سخنها صوتيا في ماء مقطر لمدة ساعة.

في ثلاث أجزاء مدتها 20 دقيقة ، قم بتخزين شرائح الغطاء النظيفة في 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء قبل الاستخدام. بجانب معطف زلات الغطاء المجفف. قم بإعداد صفيحة متعددة الآبار بزلة واحدة و 100 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل بئر.

احتضان الألواح دون أي تحريض لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء وغسل الغطاء زلات ثلاث مرات مع معقم واحد XPBS. بعد التضحية بفأر بالغ يبلغ من العمر ستة إلى 10 أسابيع مخدر بالكامل ، لا يستجيب للأحاسيس المؤلمة.

أولا ، قم بإزالة الجلد الظهري. ثانيا ، قم بتحرير جميع الفقرات من الرقبة إلى الذيل ، بما في ذلك الأنسجة المرفقة. أخيرا ، قم بإزالة أي أعضاء داخلية متصلة بداخل الأنسجة.

اشطف العمود الفقري الذي تمت إزالته باستخدام XPBS مرتين إلى ثلاث مرات ، ثم قم بتثبيته على لوحة تشريح الجانب البطني لأعلى. قم بإزالة العضلات بعناية لفضح الأعصاب الحسية. الأعصاب المتصلة ب DRGs على مستوى أسفل الظهر هي الأكثر سمكا ويمكن تحديد موقعها بسهولة.

لذلك ، بالنسبة لمعظم التجارب ، يتم حصاد DRGs القطنية فقط. اقطع كل فقرة على طول خط الوسط بمقص صغير وقم بإزالة الأقراص الفقرية بعناية لعزل الفقرات. بدءا من L واحد ، استخدم الملقط لتقسيم كل فقرة وتشريح DRGs القطنية.

حدد موقع DRGs باستخدام الملقط عن طريق تتبع كل عصب قطني باتجاه الحبل الشوكي. كرر هذه العملية ل L اثنين إلى L ستة. بعد ذلك ، استخدم مقص زنبركي لتقليم الأعصاب الطرفية الظهرية والبطنية من DRGs المعزولة.

قم بتخزين DRGs في أنبوب فوج مبرد سعة 1.5 مليلتر مملوء بوسط EM إذا لزم الأمر. يمكن استخدام نفس الإجراء لحصاد DRGs من مستويات العمود الفقري الأخرى. بعد جمع جميع DRGs ، استبدل وسيط MEM بمليلتر واحد ، وقم بتجميع محلول واحتضان DRGs عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.

بعد ذلك ، استبدل محلول الكولاجيناز ب 500 ميكرولتر من محلول هضم واحد × ثلاثي E وأعد الأنابيب إلى الحاضنة لمدة 15 إلى 20 دقيقة أخرى بعد الهضم الثاني. اغسل DRGs عن طريق استبدال المحلول بملليلتر واحد من الوسط المحضر الذي يحتوي على 5٪ FBS ، وقم بتدوير DRGs واتركها تستقر. كرر هذا الغسيل.

خطوة مرتين قبل المتابعة. بعد إزالة الغسيل الأخير ، أضف 600 ميكرولتر من وسط المزرعة وقم بالماصة برفق لأعلى ولأسفل لتصريف الأنسجة. افعل ذلك من 20 إلى 30 مرة باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر بعد أن سمح tri للأنسجة غير المنفصلة بالاستقرار في قاع أنبوب fuge الصغير.

انقل معلق الخلية فقط إلى أنبوب معقم سعة 10 مل وأضف 600 ميكرولتر آخر من وسط الاستزراع. كرر الخطوة الثلاثية حتى يتم فصل معظم الأنسجة. يحتوي المعلق على كل من الخلايا العصبية والخلايا غير العصبية.

عادة ، يتم جمع حوالي 50،000 خلية من ستة dgs تكفي لتفاعل واحد للتثقيب الكهربائي ، والطرد المركزي للخلايا المنفصلة المكونة من ستة dgs والتخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. ثم أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول التعداء الذي يحتوي على بلازميد الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الدولي بثلاث إلى أربع ضربات لطيفة من خلال طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. انقل التعليق إلى التثقيب الكهربائي ، وقم بفحص الخلايا بالكهرباء بعد التثقيب الكهربائي.

أضف على الفور 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ الذي يحتوي على FBS إلى vete. بالنسبة لمعظم التجارب التي تتطلب تعليق Resus وثقافة إعادة الطلاء ، فإن الخلايا العصبية الموجودة على طبق ثقافة بلاستيكي من 10 إلى 20 ، 000 خلية لكل بئر. ومع ذلك ، لفحص نمو المحور العصبي مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، يمكن طلاء الخلايا العصبية مباشرة على الزجاج المطلي ينزلق من ثلاث إلى 5 ، 000 خلية لكل بئر.

بعد أربع ساعات من زراعة الخلايا ، ستكون الخلايا العصبية مرتبطة بالركيزة. استبدل الوسط الملوث بمحلول التعداء برفق ب 500 ميكرولتر من الوسط الدافئ الطازج وأعد الألواح إلى الحاضنة. يمكن تحليل التعبير الجيني من بلازميدات الحمض النووي بعد ساعات قليلة من التثقيب الكهربائي.

ومع ذلك ، لتحليل تقليل تنظيم التعبير الجيني في النمو المحوري الجديد ، يلزم وقت أطول للاستزراع. بعد ثلاثة أيام من الثقافة على الألواح عالية الكثافة ، استبدل الوسط بملليلتر واحد من الوسط الطازج الدافئ وقم بغسل الخلايا العصبية في المحلول بستة إلى 10 ضربات لطيفة من الماصة. بعد ذلك ، ستبقى الخلايا غير العصبية متصلة باللوحة ، وتنقل الخلايا العصبية المعلقة إلى أنبوب فوج دقيق وتنقلها برفق من 10 إلى 15 مرة لفصل كتل الخلايا.

لضمان سهولة استخدام تعليق الخلايا العصبية المرفقة بعد ثلاثة أيام في الثقافة ، يقتصر طلاء طبق الثقافة قبل الثقافة الأولية على 1 ، 2 ، 3 ساعات فقط. أثناء خطوات التعليق S ، عادة ما نتحقق من الخلايا باستمرار تحت مجاهر مقلوبة لملاحظة ما إذا كانت الخلايا منفصلة عن لوحة الطبق الثقافي. تنزلق الخلايا العصبية على الغطاء المعد حديثا بكثافة منخفضة في اليوم التالي ، وتحلل النمو المحوري الجديد.

في حالة عدم وجود أي عوامل نمو إضافية خارج الخلية ، عادة ما تبدأ الخلايا العصبية DRG البالغة في نمو المحاور. بعد 48 ساعة من الطلاء الأول ، غالبا ما تظهر المحاور مورفولوجيا متفرعة. في المقابل ، تبدأ الخلايا العصبية المعاد طلاؤها في تمديد المحاور بعد ساعات قليلة فقط من الطلاء وتتمدد المحاور مع انخفاض التفرع.

تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا العصبية المعاد طلاؤها تشترك في خصائص مماثلة لتلك الخاصة بالخلايا العصبية المتجددة في الجسم الحي. باستخدام هذا النهج ، تم استخدام دراسة فقدان الوظيفة لفحص دور عوامل النسخ المرتبطة بتجديد المحور العصبي انظر JU في نمو المحور العصبي من الخلايا العصبية DRG البالغة. في المختبر.

أظهرت النتائج أن التثقيب الكهربائي لمجموعة من أربعة أنواع مختلفة من irna يستهدف مناطق مختلفة من cgen يقلل بشكل ملحوظ من مستويات البروتين في cgen في الخلايا العصبية DRG البالغة. بعد ثلاثة أيام من التعدي ، عندما تم إعادة طلاء الخلايا العصبية وزراعتها ، تم تقليل نمو المحور العصبي بين عشية وضحاها من الخلايا العصبية القاضية cgen بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا العصبية DRG البالغة المزروعة توفر نظاما نموذجيا مفيدا لدراسة نمو المحور العصبي من الخلايا العصبية البالغة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح الشفافية والثقافة. يجب على البالغين أيضا جذر الخلايا العصبية العقدية لدراسة تجديد حادث الغشاء في المختبر.