Name: Fluorescente In situ Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda hibridização fluorescente in situ em cromossomos mitóticos de mosquitos para mapeamento genético usando discos imaginais de larvas. Este método otimiza preparações cromossômicas de alta qualidade em Anopheles, Aedes e Culex.

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Agradecemos Sergei Demin e Tatyana Karamysheva por sua ajuda com a preparação cromossômica e FISH em Anopheles. Agradecemos também a David Severson por nos proporcionar Aedes e Culex DNA genômico BAC clones e Melissa Wade para a edição do texto. Este trabalho foi financiado por duas subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde: 1R21 AI88035-01 para Maria V. Sharakhova e 1R21 AI094289-01 para Igor V. Sharakhov.

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<li>Brown, S. E., Severson, D. W., Smith, L. A., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+the+Aedes+aegypti+mosquito+genetic+linkage+and+physical+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of the Aedes aegypti mosquito genetic linkage and physical maps.</a> Genetics. 157, 1299-1305 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Não fluorescente na hibridação in situ em cromossomos mitóticos dos mosquitos foi realizada pela primeira vez em 1990 por A. Kumar e Rai K. 17. Nesse estudo, 18S e 28S do DNA ribossomal, clonados juntos em um plasmídeo, foram colocadas para os cromossomas de 20 espécies de mosquitos. A sonda de ADN foi marcada radioactivamente e hibridada com os cromossomas de gânglios cérebro. Entre três gêneros de mosquitos, uma técnica de FISH foi desenvolvido apenas para cromossomos mitóticos a partir da linha de células de Ae. aegypti 10,18,19 e nunca foi realizada em cromossomos mitóticos de mosquitos vivos. Recentemente, foi desenvolvida uma técnica simples e robusta para a obtenção de preparações de alta qualidade dos cromossomos de IDs de 4 larvas ínstares 9. Este método permite que um grande número de cromossomas para ser obtido de uma corrediça e pode ser universalmente utilizado para todas as espécies de mosquitos. A necessidade de utilizar apenas sta não larval, pupal ou adultoges de mosquitos, para preparação da lâmina é provavelmente a única limitação do método. O método padrão FISH 12 foi otimizado para uso genômica BAC clone e IGS rDNA como sondas para os cromossomos mitóticos de Aedes, Culex e Anopheles. Para além destas aplicações específicas, os protocolos de FISH descritas aqui podem também ser usados ​​para outros fins. O protocolo de FISH avançado, que utiliza fracções de ADN C 0 t para bloquear a hibridização não específica, também pode ser aplicado para a hibridação de clones BAC ou quaisquer outros fragmentos de DNA em grandes regiões de Anopheles heterocromatina. Regiões heterocromáticas são enriquecidas com elementos transponíveis e repete outros, e sondas dessas regiões produzem normalmente sólida sobre os três cromossomos. Usando Unlabeled C 0 frações de DNA t vai ajudar a reduzir a hibridação inespecífica da sonda para os cromossomos. A versão simples do FISH protocol pode ser usado para qualquer rDNA ou as sondas de ADN repetitivo em cromossomos mitóticos de mosquitos e outros insectos. Além disso, também pode ser aplicado para a hibridação de DNA clone BAC em espécies com baixo teor de ADN repetitivo em regiões totalmente eucromático como Anopheles ou Drosophila. O protocolo proposto aqui vai ajudar a obter altamente acabados assembléias cromossomo base do genoma do mosquito e pode ser amplamente utilizado para aplicações de citogenética vários outros grupos de insetos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> MZ6 estereomicroscópio Leica </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> Um estereomicroscópio diferente pode ser usado </td></tr><tr><td> Olympus CX41 microscópio de fase </td><td> Olimpo </td><td> CX41 </td><td> Um microscópio de fase diferente pode ser usado </td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscópio fluorescente </td><td> Olimpo </td><td> BX61 </td><td> Um microscópio fluorescente diferente pode ser usado </td></tr><tr><td> Deslize ThermoBrite Sistema de Desnaturação / Hibridização </td><td> Abbott Molecular </td><td> 30-144110 </td><td> Serve como um bloco de aquecimento e uma câmara úmida </td></tr><tr><td> Agulhas de dissecação </td><td> ScienceTools Belas </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> Porta agulhas </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 dupla fosco micro desliza </td><td> Corning </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> 22x22 mm lamínulas de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Borracha Cimento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Fisher Scientific </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Prova de álcool 200 </td><td> Decon Laboratories </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido propiônico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> Di-hidrato de citrato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tri-hidrato de acetato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% NBF (formalina tamponada neutra) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Sal de sódio de sulfato de dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x tampão SSC </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM de iodeto de YOYO-1 (491/509) de solução </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade Prolongar reagente Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE Healthcare </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Polimerase I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 nuclease </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> ADN de esperma de salmão </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> EUA Biológica </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Blood and Maxikit Cultura Celular </td><td> Qiagen </td><td> 13362 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Kit construir grandes </td><td> Qiagen </td><td> 12462 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Hibridação fluorescente in situ (FISH) é uma técnica habitualmente usada por muitos laboratórios para determinar a posição cromossómica de sondas de DNA e RNA. Uma importante aplicação do presente método é o desenvolvimento de mapas de alta qualidade físicas úteis para melhorar os conjuntos do genoma de vários organismos. O padrão natural de bandas dos cromossomos politênicos e mitóticos fornece orientação para o ordenamento preciso e orientação dos supercontigs genômicos. Dentre os três gêneros de mosquitos Anopheles, ou seja, Aedes, Culex e, uma bem estabelecida técnica de mapeamento baseado cromossomo foi desenvolvido apenas para Anopheles, cujos membros possuem cromossomos politênicos legíveis 1. Como resultado dos esforços de mapeamento do genoma, 88% da Uma. gambiae genoma foi colocado para posições precisas cromossoma 2,3. Dois gêneros de mosquitos Aedes outros, e Culex, que mal polytenized b cromossomosomo de super-representação significativa de elementos transponíveis em seus genomas 4, 5, 6. Apenas 31 e 9% dos supercontings genômicas foram atribuídos sem ordem ou orientação de cromossomos de Ae. aegypti 7 e CX. quinquefasciatus 8, respectivamente. Preparação mitótico cromossoma para estas duas espécies tinham sido previamente limitado aos gânglios cerebral e linhas celulares. No entanto, as lâminas cromossoma preparadas a partir de gânglios cérebro de mosquitos geralmente contêm baixos números de placas de metafase 9. Além disso, embora a técnica FISH foi desenvolvido para cromossomas mitóticos a partir de uma linha de células de Ae. aegypti 10, a acumulação de múltiplos rearranjos cromossômicos em cromossomos das células da linha 11 torna inútil para mapeamento do genoma. Aqui descrevemos uma técnica simples e robusta para a obtenção de alta qualidade de preparações cromossômicas mitóticas de discos imaginais (IDs) de 4 larvas ínstares, que cum ser utilizado para todos os três géneros de mosquitos. Um protocolo de FISH padrão de 12 é otimizado para uso de clones BAC de DNA genômico como uma sonda em cromossomos mitóticos de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus., e para a utilização de um espaçador intergênica (IGS) região do DNA ribossomal (rDNA) como uma sonda em um. cromossomas gambiae. Além de mapeamento físico, a técnica desenvolvida pode ser aplicada a citogenética de populações e taxonomia cromossoma / sistemática de mosquitos e grupos de outros insectos.

Dentre os três gêneros de mosquito, ou seja,<em&gt; Anopheles,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt;, E<em&gt; Culex</em&gt;, Técnicas de mapeamento do genoma físicas foram estabelecidos apenas para<em&gt; Anopheles</em&gt;, Cujos membros possuem cromossomos politênicos legíveis. Para os gêneros de<em&gt; Aedes</em&gt; E<em&gt; Culex</em&gt; No entanto, o mapeamento de citogenética permanece desafiador por causa da má qualidade dos cromossomos politênicos. Aqui apresentamos um protocolo universal para a obtenção de alta qualidade preparações de cromossomos mitóticos e um protocolo FISH otimizado para os três gêneros de mosquitos.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

A hibridização in situ fluorescente (FISH) é uma técnica rotineiramente utilizada por muitos laboratórios para determinar a posição cromossômica de sondas de DNA e RNA.

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver uma técnica simples para o mapeamento cromossômico de genomas de mosquitos. Isso é realizado primeiramente utilizando discos imaginais de larvas de mosquito do quarto estádio para obter espalhamentos cromossômicos de alta qualidade. O segundo passo do procedimento consiste em preparar sondas de DNA marcadas com fluorescência e frações de DNA repetitivo não marcadas para bloquear a hibridização inespecífica da sonda.O terceiro passo é hibridizar sondas de DNA marcadas com fluorescência aos cromossomos. O passo final é detectar a localização cromossômica das sondas utilizando microscopia de fluorescência. A vantagem do uso de discos imaginais em comparação com linhagens celulares ou gânglios cerebrais é que um grande número de cromossomos com bandas espalháveis pode ser facilmente obtido por força no mosquito estrela, utilizando protocolos padrão.Incube os ovos de mosquito a 28 graus Celsius; após dois ou três dias, transfira as larvas de segundo ou terceiro ínstar para incubadoras a 16 graus Celsius ou a 22 graus Celsius, dependendo da espécie. O estágio de ínstar do desenvolvimento é determinado pelo tamanho da cápsula cefálica. Quando as larvas de quarto ínstar estiverem disponíveis, imobilize-as em gelo e, em seguida, transfira as larvas para uma lâmina com uma gota de solução hipotônica fria.Sob um microscópio estereoscópico, selecione larvas com discos imaginais em formato oval para dissecação adicional. O termo discos imaginais é abreviado como IDs. Escolher o estágio correto de larvas de mosquito com disco imaginal em formato oval é extremamente importante para obter espalhamentos cromossômicos de alta qualidade.Usando tesoura de dissecação, decepe as larvas e corte a cutícula do lado ventral do tórax. Faça um corte adicional no segundo ou terceiro segmento abdominal para dissecar o intestino. Abra agora a cutícula e remova o intestino e o corpo gorduroso das larvas.Usando papel-filtro, absorva a solução hipotônica da lâmina. Substitua a solução por uma nova gota de solução hipotônica colocada diretamente sobre as IDs. Mantenha as larvas na solução hipotônica por 10 minutos.Em seguida, remova a solução utilizando papel filtro e aplique a solução de corante carmesim. Os ID tornar-se-ão imediatamente brancos e facilmente visíveis ao microscópio. Usando agulhas de dissecação, remova os ID da larva.Adicione uma gota de ácido propiônico a 50% e, em seguida, cubra as lâminas com uma lamínula e aguarde mais 10 minutos antes de prosseguir. Agora, cubra a lâmina com papel de filtro e esmague o tecido batendo intensamente com a borracha de um lápis sobre a lamínula. Analise brevemente a qualidade da lâmina utilizando o microscópio de contraste de fase com aumento de 100 x ou 200 x.Preparações com mais de 50 espalhamentos cromossômicos podem ser consideradas adequadas para FISH. Agora, mergulhe e mantenha a lâmina em nitrogênio líquido até que pare de borbulhar. Remova a lamínula da lâmina usando uma lâmina de barbear e transfira imediatamente a lâmina para um recipiente contendo etanol 70%, resfriado a menos 20 graus Celsius.Para desidratar, colete as lâminas em etanol a 70% frio antes de prosseguir para a próxima etapa. Em seguida, desidrate ainda mais as lâminas em uma série de etanol por cinco minutos por banho e deixe as lâminas secarem ao ar à temperatura ambiente após a secagem. Armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius antes de extrair o DNA genômico de peixe e clonar o DNA de volta, além de preparar as frações de DNA repetitivo da espécie de mosquito de interesse para preparar o rótulo da sonda de DNA clonado de volta utilizando NIC tradução e I-G-S-R-D-N-A usando PCR.Os procedimentos para essas duas sondas variam ligeiramente para peixes com clones nas costas. Comece incubando as lâminas de identificação em duas XSSC por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira as lâminas para um frasco com uma solução de Pepin em ácido clorídrico e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius.Após o banho de Pepin, lave as lâminas em um XPBS por cinco minutos antes de colocá-las em um frasco com formalina em PBS. Fixe os cromossomos por 10 minutos à temperatura ambiente. Remova a formalina com uma lavagem em XPBS por cinco minutos e, em seguida, desidrate as lâminas usando a mesma série de etanol utilizada anteriormente.Finalize com a secagem ao ar das preparações. Agora desnature as lâminas em um frasco com 70% de formamida pré-aquecida por dois minutos a 72 graus Celsius. Em seguida, desidrate as lâminas em uma série de etanol seguida de secagem ao ar a 37 graus Celsius.Neste momento, prepare a mistura de hibridização para peixe. Precipite agora o DNA adicionando 0,1 volume de acetato de sódio trimolar e dois volumes de etanol. Mantenha a mistura a menos 20 graus Celsius por uma a três horas.Em seguida, centrifugue o DNA precipitado, aspire o etanol e seque o pellet em temperatura ambiente por dois a três minutos. Em seguida, dissolva completamente o pellet de DNA em 10 microlitros de hibridização.Buffer.Dessature o mix de hibridização por sete minutos a 97 graus Celsius. Em seguida, coloque imediatamente no gelo por um minuto. Depois, pré-hibridize a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos.A pré-hibridização da sonda de DNA com frações de DNA repetitivo não marcado é essencial para evitar a hibridização inespecífica da sonda aos cromossomos. Coloque 10 microlitros da mistura de hibridização sobre uma lâmina e cubra cuidadosamente. Remova quaisquer bolhas de ar acidentais aplicando pressão suave sobre o lamínula e selar as bordas do lamínula com cola de borracha. Em seguida, coloque as lâminas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova o cimento de borracha e a lamínula da lâmina. Lave as lâminas por dois minutos em solução pré-aquecida, uma a 73 graus Celsius, seguido por cinco minutos em solução dois à temperatura ambiente.Contracolorir as lâminas com yo-yo um em uma câmara escura à temperatura ambiente. Por fim, montar os cromossomos em uma pequena quantidade de reagente prolonged gold Antifa com uma lamínula e analisar os preparos para fish com uma sonda I-G-S-R-D-N-A. Pré-tratar o preparo de cromossomos com uma solução de RNA.Não adicione as frações de DNA repetitivo e desnature o preparado cromossômico e uma sonda simultaneamente. A hibridização in situ fluorescente foi realizada em cromossomos mitóticos de Aedes aegypti utilizando sondas de DNA de clone reverso. Os cromossomos são contracorados com iodeto de yo-yo um.Para comparação, o FISH utilizando sondas de DNA do clone traseiro também foi realizado em cromossomos mitóticos de *Oryzias latipes*. Finalmente, FISH utilizando uma região do I-G-S-R-D-N.Uma sonda foi realizada nos cromossomos mitóticos de anomalias, gambier após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de ologia explorarem cromossomos e realizarem mapeamento genômico em várias espécies de mosquitos e outros insetos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Análises de expressão temporal e espacial de genes têm um papel crucial em genômica funcional. Todo...

Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

A pintura cromossômica é um método útil para estudar a organização do núcleo celular e a evolução do karyótipo. Aqui, demonstramos uma abordagem para isolar e amplificar regiões específicas de interesse de cromossomos de politenso único que são posteriormente usados para fluorescentes bi e tridimensionais em hibridização in situ (FISH).

Pintura de cromossomo 2D e 3D em mosquitos da malária

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

Dada a sua anatomia simples, os testículos de Anopheles oferecem um bom modelo citológico para o estudo da espermatogênese. Este protocolo descreve a hibridização in situ por fluorescência total, uma técnica utilizada para investigar esse processo biológico, bem como o fenótipo de cepas transgênicas que abrigam mutações nos genes envolvidos na produção de espermatozoides.

Hibridação in situ por fluorescência de montagem total para estudo da espermatogênese no mosquito Anopheles

O artigo descreve os métodos e reagentes necessários para realizar a hibridização em cadeia de reação em cadeia de hibridização por fluorescência completa de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) para revelar informações sobre a resolução espacial e celular de genes de receptores quimiossensoriais na antena do mosquito e palpo maxilar.

Hibridização da Reação em Cadeia de RNA Fluorescência de Monte Inteiro Hibridização in situ de Genes Quimiossensoriais em Apêndices Olfativos de Mosquitos

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda...

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Um método high-throughput romance é descrito que permite a detecção e quantificação relativa de RNA pequeno e expressão do RNAm da única células bacterianas usando bloqueado sondas de ácidos nucléicos e citometria de fluxo por...

Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

Um método baseado em proteína fluorescente de células vivas para iluminar vacúolos celulares (inclusões) contendo clamídia é descrito. Essa estratégia permite a determinação rápida e automatizada da infectividade da clamídia em amostras e pode ser usada para investigar quantitativamente a dinâmica de crescimento da inclusão.

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

Aprenda hibridização fluorescente in situ em cromossomos mitóticos de mosquitos para mapeamento genético usando discos imaginais de larvas. Este método otimiza preparações cromossômicas de alta qualidade em Anopheles, Aedes e Culex.

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