Name: בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: למדו שיטת זרימת cytometry לבחינת התפתחות תאי T בעכברים מופעלים גנטית. השיטה מאפשרת הערכת אוכלוסיות לימפוציטים וחשיפת מסלולים קריטיים ליצירת רפרטואר תאי T תפקודי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לינג ג&#39;אנג לסיוע הטכני שלו. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-86595). TAB הוא ניו חוקר ומלומד CIHR AHFMR. QH נתמך על ידי מלגת CIHR קנדה למוסמכים - דוקטורנטים וStudentship AIHS במשרה מלאה. SAN נתמך על ידי מלגת מלכת אליזבת השנייה בוגר. AYWS נתמך על ידי מלגות לתארים מתקדמים NSERC - דוקטורט.

ראה איור 1 עבור מערך כולל של פרוטוקול הניסוי. 1. בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך מקום סטרילי פלדת רשת לצלחת 60 x 15 מ&quot;מ פטרי. יחידה אחת נדרשה לדגימת רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לכל מנה. שמור מנות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר מאובטח למשטח חיתוך, צד הגחוני פונה כלפי מעלה. עכבר תרסיס עם אתנול 70% לעיקור ולהבטיח שפרוותו מדובללת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספרי כירורגיות, להתחיל על ידי ביצוע נתיחת חתך גחון בעור הבטן ממש מעל איבר המין. להרחיב את החתך כלפי מעלה לסנטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקו האמצע, להרחיב את החתך לאורך כל הגפיים. למשוך חזרה את העור הרפוי ולהצמיד אותו למשטח החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התימוס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הקצה התחתון של עצם החזה כדי לעשות חתך.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות הכבד, לחתוך את הסרעפת כדי לנתק את כלוב צלעות ולאחר מכן לחתוך את כלוב צלעות לכל צד. חותך את הצלעות כלפי מעלה בכל צד, מקפיד להימנע מהריאות והלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את בית החזה האחורי עם מלקחיים. התימוס הוא איבר לבן, bilobed ממוקם מעל הלב. אם אשתמש בשפה השטוחה של המלקחיים לתפוס את התחתית של האונות, משוך בעדינות את התימוס ולמקם אותו על מסך רשת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את הטחול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטחול הוא איבר אדום, גלשן בצורה הממוקם בצד השמאלי של חלל הבטן של העכבר, מתחת לכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חתך לתוך חלל הבטן. משוך בעדינות את הטחול עם זוג אחד של מלקחיים, תוך שימוש בזוג השני כדי להקניט את רקמת חיבור. הנח את הטחול על מסך רשת נפרדת. </li></ol></li></ol> 2. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בבוכנה ממזרק 3 מ&quot;ל, לטחוןאיברים לתוך מסך רשת עד רקמת חיבור ורק שרידי שומן. יש לשטוף את רשת עם HBSS מהצלחת שלוש פעמים. השתמש בוכנה חדשה לכל דגימת רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרויות אחרות למאחדים רקמה ניתן להשתמש במקומה של שיטה זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב335 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes resuspend ב 500 μl של חיץ תמוגה ACK (0.15 מ &#39;NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHC0 3, 0.1 המ&quot;מ Na 2 EDTA, 7.2 pH) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. thymocytes resuspend ב 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בFACS חיץ (PBS, 1% FCS, 0.02% יזידו נתרן) ומניח בצד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לsplenocytes isotonicity ידי הוספת 5 מ&quot;ל של HBSS. splenocytes הגלולה ידי צנטריפוגה וresuspend ב 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בחיץ FACS. אם תאים צריכים להישאר סטרילי, אתה יכול להשתמש בסטרילי RPMI + 10% FCS. </li></ol> 3.תאים מכתימים עבור cytometry זרימה מטרתו של פרוטוקול זה היא להתוות אסטרטגיות לניתוח של סלקציה חיובית ושלילית באמצעות wildtype (WT) ועכברי ח.י. CD4. לשיקולים כלליים בנוגע לזרימת cytometry עיצוב, רכישה, וניתוח ניסויי, אנו מתייחסים לקוראי סקירה מצוינת על ידי טונג ואח&#39; 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 4 X 10 6 thymocytes לדגימת cytometry זרימה לכל אחד גם מצלחת 96-היטב, כמו גם 1 x 10 6 splenocytes WT לשליטת פיצוי. אם אתם משתמשים בעכברים הטרנסגניים, אתה צריך לכלול עכבר WT כבקרה בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה קולטנית FC ידי דוגרי תאים עם anti-CD16/32 (שיבוט 2.4G2) למשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בצלחת 335 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר את המכסה ולפזר נוזל מבארות ידי מצליף את הצלחת פעם אחת, עם פנים כלפי מטה לתוך כיור. Resuspend כל באר בשנת 200 μl של חיץ FACS. חזור על לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטיילי נוגדנים כמפורטים להלן, באמצעות ריכוז האופטימלי של כל נוגדן המבוסס על דילול ב200 μl של חיץ FACS לטוב. הריכוז האופטימלי של כל נוגדן מוגדר כריכוז הנמוך ביותר הנדרש כדי לתת את ההפרדה הגדולה ביותר של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. אם אין אוכלוסייה שלילית לנוגדנים נתונים, נוגדן אלוטיפ צריך להיות כלול. הנפח הכולל לכל גם ניתן scaled למטה (לדוגמה עד 100 μl לטוב) אם רוצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WT התימוס: אנטי TCRβ CD4 אנטי,, ​​אנטי CD8, אנטי CD69 או אנטי CD5, אנטי CD24 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 התימוס ח.י.: אנטי ח.י. TCR (T3.70), CD4 אנטי, אנטי CD8, אנטי CD69 או אנטי CD5, אנטי CD24 כדי להשיג הפרדה טובה יותר של CD69 lo וCD69 אוכלוסיות hi בthymocytes, מומלץ שנוגדן אנטי-CD69 עיקרי biotinylated לשמש, ואחריו כתם משני המכיל streptavidin fluorochrome מצומדות. אנו use אותה האסטרטגיה לCD5 מכתים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם 200 μl של קוקטייל נוגדנים בחיץ FACS למשך 30 דקות על קרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לצביעת קוקטייל נוגדנים, כתם כל פקד פיצוי עם נוגדן חד fluorochrome מצומדות. באופן אידיאלי, כתמי פיצוי כרוכים באותם נוגדנים אלו המשמשים בקוקטייל הנוגדנים. עם זאת, מכתים עבור כל אנטיגן מסוים אינו ריאלי עבור ניסויים גדולים יותר כאשר אנטיגנים רבים שassayed. לכן, מכתים גם עבור CD4 אנטי או נגד CD8 מומלץ בשל ביטוי גבוה של אנטיגנים אלה, או השימוש בחרוזי פיצויים. כתם בחיץ FACS למשך 30 דקות על קרח בחושך. השאר שליטת פיצוי אחד בתוליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעמים עם חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend במאגר והעברה לצינורות FACS FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דגימות על cytometer זרימה. כולל רכישת FSC-וFSC-W כדיllow לאפלית כפיל. </li></ol> 4. ניתוח של נתוני זרימת cytometry - עכברים ללא TCR המהונדסים אנו משתמשים FlowJo לניתוח נתוני cytometry זרימה. ראה איור 2 א לאסטרטגית gating לעכברים שאינם TCR מהונדסים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש FSC-ידי SSC, שער אלקטרוני על האוכלוסייה &quot;לימפוציטים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך האוכלוסייה &quot;ימפוציטים&quot;, השתמש FSC-ידי FSC-W לשער אלקטרוני אוכלוסיית lo FSC-W שלא לכלול כפילויות סלולריות וaggregrates. זה שער &quot;הגופייה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אירועים בשער &quot;הגופייה&quot;, שעלילת CD8 ידי CD4. צייר שערים לד.נ., DP משעמם, DP בהיר, מסוג CD4 + CD8 אוכלוסיות הנה CD4SP וCD8SP כמתואר באיור 2 ב &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת CD4SP וCD8SP השערים, ליצור TCRβ ידי CD24 חלקות. השתמש בכלי gating רבע לצייר שערים כמתואר באיור 2 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור neעלילת w מהשער &quot;הגופייה&quot;: TCRβ ידי CD69. צייר שערים, B, C, D כמתואר באיור 2 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עוד מזימה מהשער &quot;הגופייה&quot;: TCRβ ידי CD5. צייר השערים I, II, III, IV כמתואר באיור 2E. זוהי אסטרטגיה אחרת לבחינת סלקציה חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל DN, DP משעמם, DP בוהק, int CD4, וCD4SP CD8SP שערים מתחת &quot;גופייה&quot; לשערי I, II, III, IV, A, B, C, D (איור 2 ד, ה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר התאים בתת קבוצה מסוימת על ידי הכפלה תאית איבר בתדירות של כל שער שלאחר מכן עד שתגיע לאוכלוסיית היעד שלך. לדוגמה, מספר hi thymocytes TCRβ CD69-CD8SP היה נקבע על ידי% התאי התימוס TCR BHI x CD69-(חלק ד &#39;) x CD8SP%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספירה כבר לוקחת בחשבון את תאי חיים ומתים ולכן אינם כוללים &quot;lymphoc&quot;שער yte בחישובים שלך. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח של נתוני זרימת cytometry - TCR טרנס עכברים ראה איור 3 א לאסטרטגית gating לעכברים הטרנסגניים TCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 4.1 ו -4.2 כמו בסעיף הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לשער &quot;הגופייה&quot;, ליצור T3.70 ידי עלילת SSC ושער בT3.70 + אוכלוסיית תא לנתח תאי T אנטיגן ספציפיים (איור 3 ב &#39;). בנסיבות מסוימות, זה עשוי להיות עניין להשוואה לאוכלוסייה זו (T3.70-) האוכלוסייה הלא אנטיגן ספציפית לתאי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך האוכלוסייה T3.70 +, התיקו DN, DP, CD4SP וCD8SP שערים (האיור 3C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות בקרת WT, לצייר השערים האלה מתחת לשער &quot;הגופייה&quot; או ליצור T3.70 שער כפי שיהיו מעט מאוד T3.70 + תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לשער CD8SP, ליצורT3.70 ידי CD24 עלילה. השתמש בכלי gating רבע לחלק תאים לארבע אוכלוסיות (איור 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת היסטוגרמה מעולפת מתארת ​​CD69 ביטוי בתא DP של עכברי WT ו+ תא T3.70 DP של עכברי ח.י. CD4 (איור 4 א). חזור על פעולה כדי לבחון CD5 ביטוי (איור 4 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר המוחלט של תאים בכל קבוצת משנה של ריבית בכ4.8. </li></ol>

<ol><li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li>
<li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression%2C+clonal+deletion%2C+and+organ-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li>
<li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+learning+self-control+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li>
<li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+what+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li>
<li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Without+peripheral+interference%2C+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li>
<li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li>
<li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li>
<li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li>
<li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li>
<li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li>
<li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li>
<li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li>
<li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li>
<li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li>
<li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23(2010).</li>
<li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li>
<li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li>
<li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide%3A+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li>
<li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li>
<li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li>
<li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Nur77%2FNurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li>
<li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש לבדיקת סלקציה חיובית ושלילית בעכברים מהונדסים TCR הלא TCR מהונדס ו. פרוטוקול זה מתאר את ההכתמה של אנטיגנים על פני שטח. לניתוח נוסף של מנגנונים מולקולריים, לעתים קרובות יש צורך לבצע צביעה תאית. אנו משתמשים BD Biosciences קיט Cytofix / Cytoperm עבור רוב החלבונים תאיים וערכת כתמי Foxp3 Biosciences BD לגורמי שעתוק. אנחנו בדרך כלל לרכוש הדגימות שלנו מייד לאחר צביעה. עם זאת, דגימות ניתן לאחסן לילה במאגר FACS עם פורמלדהיד 1% ב 4 ° C בחושך. להיות מודע לכך כמה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> תמיסת המלח המאוזן של האנק HyClone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> מסכי רשת מתכת </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי (60 מ&quot;מ x 15) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> מזרקים (3 מ&quot;ל) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות חרוטים (15 מ&quot;ל) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Zeiss - פרימו סטאר </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> אוסרמדעי </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת 96-היטב </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה הרבה ערוצים </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Paa </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> יזיד הנתרן </td><td> IT ייקר הכימי ושות </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FCR מגיב חסימה </td><td></td><td></td><td> השיבוט 2.4G2 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר ח.י. TCR </td><td> eBioscience </td><td> * XX-9930-YY </td><td> השיבוט T3.70 </td></tr><tr><td> CD4 נגד עכבר </td><td> eBioscience </td><td> * XX-0042-YY </td><td> שיבוט RM4-5 </td></tr><tr><td>NTI עכבר CD8α </td><td> eBioscience </td><td> * XX-0081-YY </td><td> שיבוט 53-6.7 </td></tr><tr><td> Anti-CD24 עכבר </td><td> eBioscience </td><td> * XX-0242-YY </td><td> שיבוט M1/69 </td></tr><tr><td> TCRβ נגד עכבר </td><td> eBioscience </td><td> * XX-5961-YY </td><td> שיבוט H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-CD69 עכבר Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-י.י. * </td><td> השיבוט H1.2F3 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD5 Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-י.י. * </td><td> שיבוט 53-7.3 </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> eBioscience </td><td> * XX-4217-YY </td><td></td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> Biosciences BD - קנטו FACS </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת ניתוח cytometry זרימה </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 בינוני </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XX משתנה לפי fluorochrome וי.י. משתנים לפי גודל בקבוקון. </td></tr></tbody></table>

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T מגיבים לאנטיגנים זרים, בעוד שנשארו סובלני לאנטיגנים עצמיים. סידור אקראי של הקולטן התא T (TCR) α ולוקוסי β יוצר רפרטואר תאי T עם מגוון עצום בהספציפיות אנטיגן, הן עצמי וזרות. בחירת הרפרטואר במהלך פיתוח בבלוטת התימוס היא קריטית ליצירת תאי T בטוחים ושימושיים. פגמים בבחירה הרתי לתרום להתפתחות של הפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים 1-4. אבות תאי T מכניסים את התימוס כthymocytes (DN) השלילי כפול שלא מבטא CD4 או CD8 עמיתים לקולטנים. ביטוי של αβTCR ושני עמיתים לקולטנים מתרחש בשלב החיובי הכפול (DP). אינטראקציה של αβTCR עם (pMHC) הציג עצמי פפטיד-MHC על ידי תאים הרתי קובעת את גורלו של thymocyte DP. אינטראקציות זיקה גבוהות להוביל לבחירה וelimina שליליתtion של thymocytes העצמי תגובתי. תוצאה נמוכה זיקת גומלין בבחירה והתפתחות חיוביות של CD4 או CD8 (SP) תאי T חיוביים יחידים המסוגלים לזהות אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי 5-MHC עצמי. סלקציה חיובית ניתן ללמוד בעכברים עם רפרטואר polyclonal (wildtype) TCR ידי התבוננות הדור של תאי T בשלים. עם זאת, הם לא אידיאליים למחקר של סלקציה שלילית, הכולל מחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים. מערכות מודל רבות שמשו ללמוד סלקציה שלילית אך נבדל ביכולתם לסכם אירועים פיסיולוגיים 6. לדוגמה, בגירוי במבחנה של thymocytes חסר את הסביבה הרתי כי הוא מעורב באופן אינטימי בבחירה, ואילו ממשל של אנטיגן אקסוגני יכול להוביל למחיקה הלא ספציפית של thymocytes 7-9. נכון לעכשיו, את הכלים הטובים ביותר ללימוד בסלקציה שלילית vivo הם עכברים שמבטאים transgספציפי enic TCR לאנטיגן עצמי אנדוגני. עם זאת, רבי מודלים קלסיים TCR המהונדסים מאופיינים בביטוי המוקדם של שרשרת TCRα המהונדסת בשלב DN, וכתוצאה ממוקדמת סלקציה שלילית. המעבדה שלנו פתחה מודל CD4 ח.י., בי המהונדס ח.י. TCRα מתבטא בתנאים בשלב DP, המאפשר סלקציה שלילית להתרחש במהלך עקורים למעבר SP כפי שמתרחש בעכברי wildtype 10. כאן, אנו מתארים פרוטוקול זרימה cytometry מבוסס לבחון סלקציה חיובית ושלילית הרתי במודל עכבר CD4 ח.י.. בעוד סלקציה שלילית בעכברי ח.י. CD4 היא פיזיולוגית מאוד, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים גם על מודלים מהונדסים TCR אחרים. אנחנו גם נציג אסטרטגיות כלליות לניתוח סלקציה חיובית ברפרטואר מתאים לכל עכברי מניפולציות גנטיות polyclonal.

במודלים פיסיולוגיים TCR מהונדסים ועכברי WT, סלקציה חיובית מתחילה בשלב הבהיר DP לפני המעבר לשלב המשעמם עקורים לאחר מפגש אנטיגן. thymocytes המשעמם העקור לאחר מכן זן מסוג CD4 + שלב מעבר lo CD8 לפני שהפך thymocytes CD8SP (האיור 2B) CD4SP או. thymocytes SP הבוגר מאופיין בביטוי TCR גבוה ואובדן CD24 (האיור 2C). בעוד CD8 ידי CD4 פרופיל יכול לחשוף ליקויים בסלקציה חיובית, בחינת TCRβ ידי CD69 או CD5 יכול...

אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T<em&gt; In vivo</em&gt; באמצעות מניפולציות גנטיות בעכברי wildtype או רקע רצפטור תא T מהונדס.

מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T יגיבו לאנטיגנים זרים תוך שהם נותרים סובלניים לאנטיגנים עצמיים. ארגון מחדש אקראי של תא ה-T...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את התפתחות התאי הטימוס בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה. דבר זה מושג על ידי הכנת תרחיפי תאים בודדים מהטימוס ומהטחול של העכבר. כשלב שני, התאי הטימוס (thymocytes) והספלנוציטים נצבעים בתערובת של נוגדנים לזיהוי אוכלוסיות תאי טימוס ספציפיות.בסופו של דבר, ניתן להעריך את התדירות והמספר של אוכלוסיות לימפוציטים שונות באמצעות אנליזה של ציטומטריה זרימתית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בהתפתחות תאי T, כגון אילו גנים ומסלולים חשובים ליצירת רפרטואר תאי T פונקציונלי אך טולרנטי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות תאי T בטימוס, ניתן ליישמה גם בבחינת ההתפתחות של תאי מערכת חיסון אחרים.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתכנון תערובות הנוגדנים (antibody cocktails) עבור ציטומטריה זרימה. לפני תחילת הניתוח, הניחו רשת פלדה סטרילית בתוך צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר. לאחר מכן, הוסיפו לצלחת 5 milliliters של HBSS ושמרו את הצלחת על קרח לצורך קציר הטימוס.ראשית, השתמשו בפינצטה כדי להרים את הקצה התחתון של עצם החזה ולחשוף את הסרעפת. לאחר מכן, תוך הימנעות מהכבד, חתכו את הסרעפת כדי להפריד את כלוב הצלעות, ואז חתכו את כלוב הצלעות בכיוון כלפי מעלה מכל צד. הקפידו להימנע מפגיעה בריאות ובלב.כעת השתמשו בפינצטה כדי למשוך בעדינות את כלוב הצלעות לאחור. ה

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תימוציטים שליליים כפולים מתימוס העכבר ולאחר מכן התמרה רטרו-ויראלית ותרבית משותפת על מערכת תרבית משותפת של קו תאי סטרומה דמוי מח עצם דמוי דלתא (OP9-DL4) לניתוח פונקציונלי נוסף.

תרבית משותפת והתמרה של תימוציטים מורינים על תאי סטרומה דמויי דלתא המבטאים 4 כדי לחקור אונקוגנים בלוקמיה של תאי T

אנו מתארים פרוטוקולים להכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה

למדו שיטת זרימת cytometry לבחינת התפתחות תאי T בעכברים מופעלים גנטית. השיטה מאפשרת הערכת אוכלוסיות לימפוציטים וחשיפת מסלולים קריטיים ליצירת רפרטואר תאי T תפקודי.

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

גלה סרטונים נוספים