Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации динамики кальция непосредственно в просвете эндоплазматического ретикулума живых клеток. Это достигается путем трансдукции клеток с помощью целевого красителя, индуцированного эстераза, или векторной конструкции TED, для сверхэкспрессии карбокс-эстеразы CS-2 в эндоплазматическом ретикулуме. Далее клетки инкубируются с индикатором ацетометилового эфира кальция flu oh five NA, который диффундирует через плазматическую и ER мембраны.

Затем карбоксилэстераза расщепляется. Эфирная группа высвобождает кальций-чувствительный индикатор в er. Образуются просветные и флуоресцентные кальциевые комплексы.

Получены результаты, которые показывают изменения концентрации свободного кальция в ЭР на основе визуализации живых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся регуляции клеточного гомеостаза кальция. Сигналы кальция чаще всего контролируются в цитозоле, поэтому не так легко различить, где кальций поступает в цитозоль из внеклеточного пространства или из внутриклеточного хранилища кальция ER.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали целевую загрузку, индуцированную эстераза. При использовании этого метода кальций, высвобождаемый из ER, контролируется напрямую. Подход является нерушительным.

Плазматическая мембрана остается неповрежденной, а внутриклеточные сигнальные каскады сохраняются. Как правило, люди с разными методами будут испытывать трудности, потому что им нужен опыт. В экспрессии TED Vector мы разработали векторные конструкции, экспрессирующие центовый белок, слитый с карбоксилазой CES two.

Это позволяет нам легко идентифицировать клетки, подходящие для визуализации кальция в ходе экспериментов, которые будут клетками, характеризующимися сильной красной флуоресценцией и только умеренной или сильной флуоресценцией индикатора кальция. Эти флуоресцентные метки должны быть равномерно распределены по всему эндоплазматическому ретикулуму и отсутствовать в ядерной области. Прежде чем начать.

Приготовьте искусственную спинномозговую жидкость или А СМЖ и грипп х пять НАМ согласно текстовому протоколу. Разогрейте A CSF до комнатной температуры и добавьте глубокую глюкозу, аэрируйте A CSF с карбогеном в течение пяти минут. Затем добавляют по одному молярному бульону растворы хлорида кальция и хлорида магния до конечных концентраций по два миллимоляра каждый.

После запуска микроскопа с изображением в реальном времени и компьютерной программы начните обработку на фиктивной камере визуализации и уравновесьте систему трубок, предварительно нагрейте встроенный нагреватель раствора и камеру визуализации на предметном столике микроскопа и уравновесьте систему до 32–37 градусов Цельсия. Перед началом процедуры загрузки красителя в ячейки добавьте 100 микролитров предварительно подогретого А ликвора в одну 0,5 микролитра аликвоты пяти миллимоляров от пяти миллимоляров и растворите раствор на водяной бане в течение 90 секунд, перенесите 400 микролитров предварительно подогретого раствора визуализации в одну лунку четырех- или 24-луночной пластины. Добавьте раствор D в ту же лунку, чтобы получить 500 микролитров пятимикромолярного раствора.

Затем осторожно поместите крышку с клетками в лунку для инкубации на соответствующий период времени В инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия время загрузки и концентрация D зависят от типа клетки, плотности клеток и конкретных потребностей эксперимента. Длительное время инкубации может нанести вред клеткам, особенно первичным нюансам и глиальным клеткам, а это имеет решающее значение для реакции на физиологические раздражители. Инкубация продолжительностью более 30 минут будет полезна только для экспериментов по локализации ER кальция для изучения распределения ER кальция в небольших микродоменах, например, MUEs шипиков Сразу после инкубации перенос покровного стекла в другую лунку для клеточной культуры, содержащую раствор для визуализации.

Чтобы подготовиться к установке элементов в камеру визуализации, с помощью малярной кисти нанесите на камеру визуализации смазку для высокого вакуума. Мы используем самодельные камеры визуализации для защитных накладок от 10 до 12 миллиметров с небольшим объемом, что позволяет обеспечить высокую скорость перфузии до 15-кратной замены буфера в минуту. Возьмите крышку с гриппом и заряженными ячейками и добавьте небольшую каплю раствора для визуализации, чтобы она оставалась влажной.

Затем переверните крышку вверх дном и установите элементы в камеру визуализации. С помощью ватной палочки вдавите защитный лист в силиконовый клей и сотрите остатки буфера с нижней части стекла. Затем поменяйте макет камеры визуализации на экспериментальную камеру визуализации.

Промойте клетки в течение пяти-10 минут непрерывной перфузией для выбора клеток. Используйте минимальное количество лазерного излучения для предотвращения быстрого фотообесцвечивания гриппа ох пять и кальция два в скорой помощи, высокую скорость сканирования от двух до четырех герц, небольшой размер изображения и высокий коэффициент усиления, установленный под микроскопом. По данным эксперимента с растением.

В начале эксперимента задокументируйте клеточное распределение гриппа oh five и кальциевой метки, а также красной флуоресцентной метки красной конструкции carbox cel esteraza. В интересующей вас клетке репрезентативные нейроны с помощью стеков изображений X, YZ с высоким разрешением выполняют визуализацию XYT для мониторинга динамики кальция ER в определенных экспериментальных условиях. Типичные настройки для нашей системы перечислены в таблице 2 текстового протокола: Мониторьте изменения ER кальция при непрерывной перфузии с визуализацией раствора, скорости обмена буфера составляют 1,5 мл в минуту для промывки клеток и истощения запасов за счет блокирования саркоэндоплазматического ретикулума кальция, два а ТПА и три миллилитра в минуту для стимуляции ТП и ДГПГ и агонист для метаботропного глутаматного рецептора.

Здесь глиальные клетки стимулируются 200 микромолярными А TP в течение 10 секунд. Чтобы обработать изображения, откройте стек изображений в программе Image J для многоцветного изображения. Разделяйте каналы RBG по запросу программного обеспечения.

Определите интересующие вас регионы. В зависимости от цели нарисуйте области интереса вокруг всей ER или небольших областей ER. Используйте плагин анализатора временных рядов для считывания средней интенсивности пикселей в интересующей области.

Рассчитайте скорректированные на фон относительные изменения флуоресценции по дельте F над нулем F, используя эту формулу. Представьте относительные изменения флуоресценции в виде следа с дельтой F над нулем F для оси Y и временем для оси x. На этом рисунке корковые астроциты и нейроны гиппокампа экспрессируют красный флуоресцентный вектор TED и помечены низкоаффинным кальциевым индикатором.

Флуоресцентный индикаторный комплекс кальция локализуется в эндоплазматическом ретикулуме всех типов клеток. На этом рисунке показаны глиевые клетки, меченные гриппом и пятью N. Во время лечения CIN наблюдается яркое цитозольное мечение, если плазматическая мембрана клетки повреждена как до, так и после лечения CIN.

Это показывает, что грипп oh five N также высвобождается в цитозоле эндогенными эстеразами. В этом эксперименте после мечения TED гриппом или пятью N er истощение кальция культивируемых нейронов гиппокампа вызвано циклоновой кислотой. Обратите внимание, что наблюдаемое здесь огромное изменение средней плотности флуоресценции на область интереса представляет собой серию замедленной съемки с клетками кортико GL мыши, которые стимулируются с помощью TP. Флуоресценция резко падает и восстанавливается, представляя собой высвобождение и пополнение ER кальция Одновременно флуоресценция красного флуоресцентного белка незначительно уменьшается вследствие диаграмм обесцвечивания сланца, показывающих изменение интенсивности флуоресценции с течением времени в некоторых, но не во всех экспериментах.

Значения флуоресценции не возвращаются к исходным уровням интенсивности флуоресценции, потому что некоторые комплексы гриппа или пяти N теряются во время стимуляции. В этом фильме показана карбоксилаза из двух инфицированных клеток BHK 21 в высоком разрешении, меченная противогриппозными пятью N-кальциевыми комплексами и стимулированная TP. Обратите внимание, что индуцированное TP высвобождение кальция и пополнение запасов кальция ER визуализируются в тонких структурах канальцев ER. При проведении этой процедуры важно помнить, что только совершенно здоровые клетки проявляют физиологическую реакцию кальция.

Поэтому мы рекомендуем провести серию экспериментов по взаимосвязанному гомеостазу кальция в один день с одной и той же партией клеток. Исходя из нашего опыта, лучше всего работает краситель гриппа пяти N, но этот показатель кальция не очень устойчив к прорыву. Таким образом, этот метод выиграет от разработки более устойчивых к отбеливателю низкоаффинных кальциевых показателей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать Е-кальций-транзиент с синтетическими низкоаффинными показателями кальция. Эти показатели позволяют контролировать динамику кальция с высоким временным разрешением. По этой причине наш метод может быть полезен для исследования кальциевых сигнальных каскадов, участвующих в синаптической пластичности, и для мониторинга изменений в гомеостазе кальция в клеточных моделях нейродегенеративных заболеваний.