Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Este sistema experimental utiliza la agroinfiltración para entregar de manera efectiva las construcciones de genes a las hojas para la producción de altos niveles de proteína recombinante. Primero, cultive las plantas de hamana final en un ambiente controlado durante seis semanas, tres días antes de la infiltración. Preparar los cultivos de agrobacterias que contienen el gen diana que se expresará en las plantas el día de la infiltración.

Introducir los cultivos de agrobacterias en el tejido vegetal mediante jeringa o infiltración al vacío. Resultados como la intensidad de la fluorescencia verde de GFP en hojas de tabaco bajo luz ultravioleta demuestran una expresión robusta de proteínas recombinantes en plantas que rivaliza con la de los sistemas de expresión actuales basados en bacterias e insectos en mamíferos. La agroinfiltración es una forma eficaz de introducir genes trans en las células de las plantas, lo que conduce a un alto nivel de expresión de proteínas recombinantes.

Se puede utilizar para una amplia gama de especies de plantas. Y lo que es más importante, puede ampliarse para la producción comercial de proteínas farmacéuticas. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la cinética y la expresión de GFP y se puede aplicar a otras proteínas como vacunas de subunidades, anticuerpos monoclonales recombinantes y se puede usar en tratamientos para el cáncer y las enfermedades infecciosas.

Un experimento exitoso requiere condiciones óptimas tanto para el cultivo de bacterias como para el material vegetal. Este proceso de infiltración es más fácil de replicar después de una demostración visual. Comience colocando hasta 60 gránulos de turba en una bandeja de propagación.

Agregue cuatro litros de agua del grifo y deje que los pellets de guisante absorban el agua durante dos horas. Ahora, agregue dos semillas de hamana en cada gránulo de turba y cubra la bandeja con una cúpula de plástico transparente para la germinación. Coloque las semillas en un ambiente de 25 grados centígrados, 84% de humedad.

Dos semanas después de la siembra, retire la cúpula y transfiera las plantas a una nueva bandeja. Luego agregue dos litros de 1,48 gramos por litro. Fertilizante de Jack: Continúe cultivando las plantas a 25 grados centígrados.

50% de humedad ambiental cada dos días. Suministra dos litros de fertilizante jack's por bandeja. En la cuarta semana, transfiera las plantas con gránulos de turba a una nueva bandeja que albergue seis plantas para un mayor crecimiento hasta las seis semanas de edad.

Elija plantas de cuatro, seis semanas de edad y hamama con cinco a seis hojas cada una para una infiltración completa con las cepas agrobacterianas que albergan los genes de interés. Una hoja para el control negativo y una hoja para la infiltración puntual. Haz una pequeña muesca con una aguja en la epidermis en la parte posterior de la hoja, asegurándote de no perforar la hoja por ambos lados.

Sujete firmemente la parte delantera de la primera hoja mientras aplica una suave contrapresión en el cuello. Con el pulgar de una mano. Inyecte las mezclas de agrobacterias en el tampón de infiltración en el cuello con una jeringa, una aguja.

Continúe inyectando las mezclas de agrobacterias en la muesca hasta que el círculo verde más oscuro deje de expandirse. Luego cree otra muesca y repita las inyecciones hasta que toda la hoja se infiltre y toda la hoja se vuelva de color verde más oscuro. Las infiltraciones completas de las tres primeras hojas y la última hoja de la cuarta hoja de cada planta se infiltran con combinaciones de vectores de los cuatro vectores virales de Géminis o de tres vectores magcon.

Además, haga una muesca para cada combinación de cepas de agrobacterium e infiltre cada muesca con una combinación. Después de la infiltración, traslade las plantas de vuelta a la sala de crecimiento y controle la expresión de proteínas entre dos y 15 días. Después de la infiltración, coloque una tina en un desecado al vacío y transfiera tres litros de tampón de infiltración que contenga las cepas de agrobacterias.

A continuación, conecte el desecado a una bomba de vacío de diafragma de marca de vacío. Ahora coloque una planta boca abajo en la placa de desecación y baje la placa con la planta hasta que todo el sistema de hojas y tallos se sumerja en el tampón de infiltración con la placa descansando sobre la tina. A continuación, coloque la junta tórica desecada a lo largo del borde.

Después de colocar la tapa de desecación en la cámara, encienda la bomba de vacío y comience a cronometrar cuando el vacío alcance los 100 milibares. Después de apagar la bomba de vacío, abra lentamente la válvula de liberación en el desecado después de un minuto a 100 milibar para permitir la entrada de agrobacterias en los espacios intersticiales del tejido vegetal sumergido. Repite esta infiltración.

Primeros pasos para asegurar una buena infiltración. A continuación, retire la planta del desecado y vuelva a colocarla en posición vertical. Traslade las plantas de vuelta a la sala de crecimiento y controle la expresión de proteínas entre dos y 15 días después de la infiltración.

Para demostrar la efectividad de la infiltración de agrobacterias en el tejido vegetal, probamos la expresión de dos proteínas fluorescentes, GFP y Ds rojo por dos vectores virales de plantas deconstruidos diferentes, Gemini, viral y magcon para end. Hojas de Hamana que fueron infiltradas en su totalidad con agrobacterias que contenían vectores virales Géminis. La expresión de GFP se observó en toda el área foliar bajo luz ultravioleta, a partir de PI 2D y alcanzó un pico de acumulación a cuatro DPI.

En contraste, las hojas infiltradas con el vector magcon que contenía combinaciones de agrobacterias mostraron fluorescencia GFP solo después de cinco DPI y alcanzaron su máxima acumulación a siete DPI. No se observó fluorescencia verde en las hojas infiltradas con mezclas de agrobacterias de control negativo de EP one 10 más P 19, lo que indica que la fluorescencia era específica del gen GFP y no era el resultado de la fluorescencia de fondo de las hojas. En su pico de acumulación, la fluorescencia del vector magcon expresada a GFP es más intensa que la del vector viral Gemini.

No se observó necrosis importante en las hojas infiltradas con constructos GFP cuando ambas proteínas fluorescentes se expresaron en la misma hoja a través de vectores virales Gemini con infiltración de manchas en jeringas, se detectaron con su color fluorescente esperado en el lugar donde se infiltraron. Curiosamente, la infiltración de GFP y DS RED dio lugar a una fluorescencia amarillenta. También se examinó la infiltración al vacío para desarrollar un método de infiltración agrícola escalable que se pueda utilizar para la producción a gran escala de proteínas recombinantes mediante sistemas de expresión transitoria de plantas.

Como era de esperar, se observó fluorescencia de GFP para todas las hojas de la planta infiltrada en comparación con la infiltración con jeringa. Es más robusto y puede lograr la infiltración de cada planta en un plazo mucho más corto. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 48 horas.

La mayoría de las veces es para el cultivo agrobacteriano, ya que el tiempo de infiltración real es de solo unos minutos, para una eficiencia óptima de infiltración agrícola y una expresión de proteínas específica. Siga el protocolo. Recuerde controlar los parámetros críticos, incluidas las condiciones de crecimiento de las plantas, la concentración de agrobacterias, la presión de vacío y la duración en el campo de la biotecnología vegetal.

Este enfoque experimental se puede utilizar para explorar el desarrollo y la bioproducción de nuevas proteínas farmacéuticas en una amplia gama de especies de plantas. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo usar la agroinfiltración para entregar construcciones de genes objetivo en la planta y permitir que los sistemas de expresión transitoria de la planta produzcan proteínas recombinantes, rivalizando con las de los cultivos de células de insectos y bacterias de mamíferos.