זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתכנן חיישן ביולוגי אופטי ללא תוויות לזיהוי מהיר של חיידקים המבוסס על סיליקון נקבובי בעל מבנה ננו. זה מושג על ידי בניית סיליקון נקבובי מחומצן שישמש כאלמנט המתמר האופטי של החיישן הביולוגי. כשלב שני, בדיקות לכידה ספציפיות, כגון נוגדנים, משותקות על פני השטח הנקבובי כדי לספק את המרכיב הפעיל של החיישן הביולוגי.

לאחר מכן, החיישן הביולוגי נחשף לחיידקי המטרה על מנת ללכוד ישירות את תאי החיידקים על הנוגדן. מתקבלות תוצאות משטח סיליקון נקבובי מחומצן שונה המראות שינויי עוצמה בספקטרום ההפרעות האופטיות של הסרט הדק של החיישן הביולוגי. בשל לכידת חיידקים, נעשה שימוש במיקרוסקופ אור על מנת לאשר את נוכחות החיידקים על פני החיישן הביולוגי.

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות כמו תרבית וטכניקות קונבנציונליות, הוא שהשיטה שלנו מזהה נוכחות של חיידקים בצורה מהירה מאוד תוך פחות משעה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על אתגרים מרכזיים בניטור סביבתי של מיקרואורגניזמים ספציפיים, כמו גם להבטיח את בטיחות המים והמזון. זה גם מאפשר זיהוי של מיני חיידקים ספציפיים בזמן אמת ובהגדרות נקודת טיפול כדי להתחיל לחרוט פרוסות סיליקון בתמיסה של שלושה לאחד של מימן פלואוריד ואתנול למשך 30 שניות בצפיפות זרם קבועה של 385 מיליאמפר לסנטימטר מרובע.

שימו לב שמימן פלואוריד הוא נוזל מאכל מאוד ויש לטפל בו בזהירות רבה. שוטפים את פני השטח של סרט הסיליקון המסכן שנוצר באתנול מספר פעמים. לאחר מכן יבש את הסרטים תחת גז חנקן יבש ולאחר מכן חמצן את דגימות הסיליקון הנקבוביות הטריות שנחרטו בתנור צינור בטמפרטורה של 800 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת באוויר הסביבה.

כדי לבצע פונקציונליזציה ביולוגית של דגימת הסיליקון הנקבובית המחומצנת יש לדגור תחילה את הסרט למשך שעה אחת ותמיסת MPTS של 95%. לאחר שטיפה עם טולואן, מתנול ואצטון, יש לייבש את דגימת הסיליקון הנקבובית המחומצנת שטופלה בסינוס תחת גז חנקן יבש. לאחר מכן, דגרו את הדגימה שהשתנתה בסינוס במיליליטר אחד של תמיסת ביוטין PEOI oto acetyl 100 מולרית למשך 30 דקות.

שטפו את הדגימה המטופלת בביוטין שהתקבלה עם תמיסת מלח 0.1 פוספט מולארי או PBS מספר פעמים. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 30 דקות במיליליטר אחד של 100 מיקרוגרם לתמיסת הוכחה למיליליטר סטרפטוקוקוס לפני שתשטפו אותה שוב עם תמיסת PBS מספר פעמים. לאחר מכן דגרו את דגימת הסיליקון הנקבובית המחומצנת שהשתנתה בסטרפטווידין למשך 30 דקות במיליליטר אחד של 100 מיקרוגרם למיליליטר, אי קולי ביוטיניל, נוגדן IgG חד שבטי, או עם 100 מיקרוגרם למיליליטר.

ארנב ביוטיניל IgG לתיוג פלואורסצנטי של הפיגום. דגרו את המשטחים ששונו ב-IgG עם 15 מיקרוגרם למיליליטר. פלואורסצאין תייג אנטי ארנב IgG למשך 40 דקות.

דגירה עם 15 מיקרוגרם למיליליטר. פלואורסצאין תייג את ה-IgG האנטי-אמריקאי כבקרה. בדוק את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר שטיפת הדגימות ששונו בתמיסת PBS מספר פעמים.

טפח חיידקי e coli K 12 בצינור של 10 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של מדיום לוריא בריטני או LB. דגרו על החיידקים במהלך הלילה תוך רעידות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר גידול לילה. במדיום LB, קרא את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר או OD 600 באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז החיידקים.

מספר התאים עומד ביחס ישר למדידת OD 600. מקום. ה-IgG שינה פיגומי סיליקון נקבוביים מחומצנים ואת הבקרה. דגימות סיליקון נקבוביות מחומצנות מסודרות בתא זרימה פרספקס בהתאמה אישית.

תקן את תא הזרימה כדי להבטיח שהחזרת הדגימה נמדדת באותה נקודה במהלך כל המדידות. דגרו את הדגימות עם תרחיף Coli K 12 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את תרחיף החיידקים על ידי שטיפת התא במי מלח, 0.85% משקל לנפח למשך 30 דקות.

עקוב אחר השינויים בנתוני הרפלקטיביות לאורך הניסוי בספקטרומטר CCD. בצע את כל המדידות האופטיות בסביבה מימית לאחר איסוף ספקטרום על ספקטרומטר CCD שנותח על ידי יישום טרנספורמציה מהירה של ארבע אוזניים. לבסוף, אשר את נוכחות החיידקים על פני החיישן הביולוגי על ידי התבוננות בדגימות תחת מיקרוסקופ אור זקוף מיד לאחר ניסוי החישה הביולוגית.

מוצג כאן מיקרוגרף אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה של סרטי הסיליקון הנקבוביים לאחר חמצון תרמי. שכבת הסיליקון הנקבובית המחומצנת מאופיינת בנקבוביות גליליות מוגדרות היטב בקוטר של 30 עד 80 ננומטר. הצמדת הנוגדנים למשטח הסיליקון הנקבובי המחומצן מאושרת על ידי תיוג פלואורסצנטי, ואחריו תצפית על פני השטח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בנוסף, מחקרים פלואורסצנטיים מאפשרים לאפיין את הפעילות והספציפיות האנטיגנית של הנוגדנים המשותקים על פני השטח על ידי קשירה של IgG נגד ארנב ואנטי עכבר כבקרה. כמו כן מוצג ניסוי הבקרה ללא IgG כדי להדגים חיידקים שינויים בחישה ביולוגית במשרעת או בעוצמת האור המוחזר ממבנה הסיליקון הנקבובי המחומצן מנוטרים במהירות עבור ספקטרום הטרנספורמציה שלך של החיישן הביולוגי לפני ואחרי הכנסת חיידקי ה-e coli מוצג כאן בעקבות חשיפה לחיידקי אי קולי. ירידה בעוצמה של שבע פלוס מינוס 1% נרשמת בעוד שנצפו שינויים לא משמעותיים עבור משטח הסיליקון הנקבובי המחומצן ללא שינוי.

יתר על כן, על מנת לאשר את נוכחותם של תאים שנלכדו על פני הסיליקון הנקבובי המחומצן, החיישנים הביולוגיים נצפים תחת מיקרוסקופ אור מיד לאחר השלמת ניסוי החישה הביולוגית המוצג. להלן תאי חיידקים משותקים על פני החיישן הביולוגי. אמנם לא נצפים תאים על משטחי הבקרה הלא משתנים לאחר שליטה, אך ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה אם מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן חיישן ביולוגי אופטי ספציפי לניטור אנליט מטרה.