Name: 成像变性的胶原股在体内和体外通过光引发杂交笼胶原蛋白仿生肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 了解利用光引发笼胶原蛋白仿生肽进行体内近红外荧光成像和体外组织切片染色的方法。该技术通过紫外光激活肽与变性胶原股杂交，为研究组织重塑和开发相关疾病诊断工具提供新途径。

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作者感谢 Gilbert Green 提供的技术支持。本研究由授予 S.M.Y. 的 NIAMS/NIH（R01-AR060484）和 DOD（W81XWH-12-1-0555）资助项目以及授予 M.G.P. 的 NIH（U24 CA92871 和 U54 CA151838）资助项目提供支持。

所有动物实验均按照约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的规定进行。
1. 活体近红外（NIR）荧光成像技术用于骨骼胶原重塑研究 In vivo
<ol>
	<li>光激活笼状 CMP 及尾静脉注射
	<ol>
		<li>为每只小鼠（体重 20–30 g）准备 110 µl&#160;笼状 CMP 溶液：100 µl&#160;用于给药，额外加入 10 µl&#160;以补偿转移和注射过程中可能的损失。将 11 µl&#160;IR680-Ahx-NB(GPO)9 储备液（400 µM）与 11 µl&#160;100 µM 半胱氨酸无菌 PBS 溶液混合，然后用 1×&#160;PBS 缓冲液定容至 110 µl&#160;。最终肽溶液在 100 µl&#160;1×&#160;PBS 溶液中含 4 nmol IR680-Ahx-NB(GPO)9 和 1 nmol 半胱氨酸。</li>
		<li>使用透明筒身、小规格针头（28–30 G）的 0.5 ml&#160;胰岛素注射器缓慢吸取肽溶液，并小心去除气泡。打开紫外灯，预热 2–5 分钟。</li>
		<li>将装有肽溶液的注射器直接置于紫外灯（365 nm，&#62;25 mW/cm2）下照射 5 分钟，以完成光激活。</li>
		<li>同时，将小鼠置于加热灯下的固定器中；使用永久性记号笔&#160;在尾巴上标记，或采用耳标、脚趾纹身等其他识别方法&#160;，并用 70% 酒精对尾巴进行消毒。</li>
		<li>紫外激活后立即向尾静脉注射 100 µl&#160;经紫外激活的 IR680-Ahx-NB(GPO)9 溶液，优先选择尾部后段进行注射。注射完成后将小鼠放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原重塑活性的近红外荧光&#160;成像
	<ol>
		<li>使用 Pearl Impulse 2.0 软件将脉冲成像仪成像床的加热板温度设定为 37 °C。</li>
		<li>将无毛或脱毛的小鼠放入麻醉诱导室，其中通入含 2% 异氟烷的氧气。通过观察小鼠在操作过程中是否无活动以及呼吸频率（约每秒 1 次）来确认麻醉深度。</li>
		<li>小鼠麻醉后，打开 Pearl 成像仪抽屉，将动物放置于成像床上。迅速取下鼻锥塞子，将小鼠口鼻滑入鼻锥内，以通过鼻锥持续输送含 2% 异氟烷的氧气（流速 2 L/min）维持麻醉状态。小鼠安置妥当后关闭抽屉。</li>
		<li>当仪器在图像软件面板上显示&#34;就绪&#34;时，点击&#34;700 通道&#34;、&#34;白光&#34;和&#34;85 微米&#34;选项，然后点击&#34;采集图像&#34;按钮。系统将自动对焦和曝光，采集近红外（激发波长 685 nm，发射波长 720 nm）和白光照片。</li>
		<li>记录完成后，打开抽屉，翻转小鼠，并从另一角度采集图像。可将小鼠以腹侧（前侧）、背侧（后侧）或侧面朝向相机放置。可使用窄条胶带作为固定装置，伸展其四肢，以获得最佳兴趣区域（例如&#160;胸廓、踝关节和腕关节）视野。</li>
		<li>根据给药剂量（约 4 nmol/只小鼠），观察 IR680-CMP 在骨骼中摄取的合适时间为注射后 24–96 小时（h.p.i.）。为获取高分辨率图像，在注射后 72 h.p.i. 处于深度麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠，使用手术镊和剪刀去除皮肤（及毛发），并按照上述方法进行近红外荧光成像。</li>
		<li>分析所获得的近红外荧光图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在离体&#160;组织切片中观察胶原蛋白
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>在去离子水中配制1 ml&#160;10% (w/v) BSA溶液。在室温水浴中解冻1 ml&#160;山羊血清。裁剪数片大小约为2 cm ×&#160;5 cm的Parafilm封口膜。</li>
		<li>通过混合500 µl&#160;山羊血清、1 ml&#160;10×&#160;PBS和8.5 ml&#160;去离子水，配制10 ml&#160;封闭缓冲液。通过将50 µl&#160;10% (w/v) BSA与4.45 ml&#160;去离子水及500 µl&#160;10×&#160;PBS混合，稀释配制5 ml&#160;CMP稀释缓冲液。</li>
		<li>使用CMP稀释缓冲液将羧基荧光素标记的笼状CMP（CFNB(GPO)9）储备液（480 µM）稀释至5 µM。最佳CMP浓度因组织类型和样本性质而异，通常在2.5–30 µM之间。建议每张组织切片使用100 µl&#160;染色液。配制好的CMP溶液应避光保存。</li>
		<li>将小鼠角膜组织切片置于室温下平衡。将切片在1×&#160;PBS缓冲液中孵育5分钟。本实验所用小鼠角膜组织经4%多聚甲醛PBS溶液固定1小时，用Tissue-Tek O.C.T.包埋剂冷冻保存，冷冻切片厚度为8 µm，并贴附于带电荷的玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织染色与成像
	<ol>
		<li>将切片置于湿化 chamber 中。向每张切片加入0.5 ml&#160;封闭液，在室温下孵育30分钟。用纸巾轻轻吸去切片上的封闭液。</li>
		<li>向每张切片的组织区域加入约100 µl&#160;CFNB(GPO)9溶液，使其完全覆盖组织切片。孵育2分钟，使CMP溶液充分渗透组织。</li>
		<li>打开紫外灯。待灯管预热后，将覆盖有CMP的组织切片暴露于紫外光下6分钟（365 nm，~8 mW/cm2），以解笼释放活性CMP。紫外照射后，用一片Parafilm覆盖每张切片的组织区域，防止干燥。将切片放回湿化 chamber 中，在4 °C下孵育2小时。</li>
		<li>用1×&#160;PBS将DAPI溶液稀释至1:3,000。完成CMP染色后，用镊子小心移除Parafilm&#160;，并将切片在纸巾上轻拍以去除多余的CMP溶液。向每张组织切片加入约100 µl&#160;稀释后的DAPI溶液，在室温下孵育1分钟。</li>
		<li>染色完成后，将切片浸入盛有1×&#160;PBS缓冲液的染色缸中，洗涤5分钟。更换新鲜1×&#160;PBS，重复洗涤3次，以去除未结合的染料。</li>
		<li>在组织区域滴加一滴封片剂，盖上盖玻片，注意避免产生气泡。将切片放入纸板片盒中，避光保存。</li>
		<li>使用荧光显微镜对组织切片中的胶原纤维（FITC通道）和细胞核（DAPI通道）进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li>
<li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis%3A+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K%3A+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li>
<li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li>
<li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li>
<li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li>
<li>Bächinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix%22%5BJournal%5D)">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li>
<li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li>
<li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li>
<li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li>
<li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li>
<li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li>
<li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides%3A+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li>
<li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li>
<li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides%3A+transition+from+third+to+first+order+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li>
<li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Prot.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

如本方案所示，CMP的递送过程十分简便，因为与常规尾静脉注射方案相比，仅需增加紫外光激活笼锁CMPs这一步骤。19关键是将肽探针以未解笼且处于亚稳态的单链形式注入。笼基团可防止CMP自组装以及与胶原蛋白结合。图2B）直至通过紫外光照射去除后，CMP 才开始折叠形成三螺旋结构。注射制剂中含有半胱氨酸，可在紫外照射期间迅速与裂解的笼状基团反应，以最小化毒性。多种不同品系的小鼠（例如 SKH-1 和 DR-1 小鼠已使用该配方进行测试，我们在长达六个月的时间内未检测到这些小鼠出现任何行为异常或其他健康缺陷。如果注射未在紫外线照射后立即进行，CMPs 将折叠成无杂交能力的同源三聚体三重螺旋结构。 图 2C 显示了一种极端情况，即在注射前，由于较长的延迟时间，CMPs 已完全重新组装成三重螺旋结构&#62;2 天）。为避免此问题，CMP 溶液应以相对较低的浓度配制（例如 约 40 µM），并在紫外线解笼后立即注射到小鼠体内。由于 CMP 在稀释条件下三重螺旋折叠速率较慢（复性半衰期： &#62;50 分钟）以及短暂的紫外照射和注射时间（总共 5~7 分钟），当遵循本方案时，大部分 CMP 会以单链形式进入血液。注射后，由于在血池中浓度被稀释了 20 倍，导致重组速率显著降低，因此预期 CMP 将保持为单链形式18如果注射延迟（例如&#160;由于动物操作的原因，且怀疑存在同源三聚体的重折叠，部分组装的肽可通过加热至70 °C以上使CMP解离为单链，随后迅速冷却并注射，从而重新激活。尽管这种加热解离的CMP使用起来较不方便，但仍能显示出预期的结果 体内 靶向（图2D).
在本实验中，使用裸鼠进行近红外（NIR）荧光成像，因为毛发最多可阻挡50%的NIR信号。当使用有毛小鼠模型（尤其是黑毛小鼠）时，我们建议在成像前使用电动剃毛器或脱毛剂对感兴趣区域进行剃毛处理。在图1中，动物腹部区域出现假阳性信号，这是由于动物饲料中叶绿素的自发荧光所致。此类背景信号可通过在成像前约4天将小鼠更换为纯化饲料而显著降低。如图1和图2A所示，尾椎部位存在强烈的CMP摄取。因此，为避免因尾静脉注射不完全而产生的伪影，我们建议在尾部后段进行注射，以确保注射部位不在荧光图像的采集范围内。
标记的 CMP 可实现对胶原重塑特定位置的靶向与成像 体内 使用其他方法难以检测。例如，基于ELISA的血液和尿液检测对切割后的胶原端肽片段具有敏感性，但该方法无法定位胶原 turnover 的来源，因其靶向的是可溶性抗原。该方法的主要局限性在于 体内 使用近红外标记CMP的成像技术受限于穿透深度的衰减以及邻近聚集的红细胞导致的淬灭效应，因为血红蛋白是680/710 nm近红外染料的内源性淬灭剂。CMP的未来应用 体内 成像技术包括使用标记了直接发射伽马射线的放射性核素或正电子发射核素的CMPs进行SPECT或PET成像，用于诊断涉及胶原重塑的疾病状态（例如&#160;骨质疏松症、关节炎、动脉粥样硬化和纤维化）。这些放射性标记的CMP类似物将克服因组织深度及红细胞聚集导致的信号衰减限制，从而实现对病变组织的定量测量。此外，相对较晚的成像时间（例如&#160;48-96 小时后感染（h.p.i.）时，由于 CMPs 结合与清除速度较慢，可能难以追踪胶原重塑过程中的快速变化。这一局限性可通过进一步优化 CMP 成像探针的结合动力学与亲和力来克服。由于 CMP 可结合结构稀少的变性胶原，因此基于 CMP 的胶原成像与仅能成像胶原纤维的二次谐波生成显微技术互为补充。5.
在使用荧光标记的CMP对组织切片进行染色时，我们发现将样品在4 °C条件下孵育于紫外光活化的肽溶液中效果更佳，因为较低温度有利于三螺旋杂交的进行1,20。同时发现，将载玻片浸入染色缸中的新鲜PBS缓冲液中是去除未结合CMP的最有效方法，其效果明显优于仅通过移液方式将洗涤缓冲液加至样品表面。CMP与胶原链的杂交具有高度特异性和稳定性；因此，本视频中介绍的简单染色方案可轻松修改，用于共染其他生物标志物，以及在未固定的组织切片中识别降解的胶原蛋白。该方法是检测各种组织学样品中纤维状胶原蛋白的一种有效且便捷的替代方案，可取代抗胶原抗体的使用。

胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，在组织发育和再生过程中发挥着关键作用，能够支持细胞的增殖与分化。纤维状胶原（例如&#160;Ⅰ型、Ⅱ型）存在于结缔组织中，赋予组织机械强度；而网状胶原（Ⅳ型）则形成基底膜的基本支架，细胞依附其上并构建出有序的组织结构。胶原重塑过程包括胶原的降解（由蛋白酶介导）和合成（由生长因子促进）。尽管胶原重塑（如在骨骼中）属于正常组织更新的一部分，但过度的重塑活动或在异常部位发生的重塑通常提示机体对损伤的伤口愈合反应，或慢性病理状态，如癌症、骨质疏松症、关节炎和纤维化1-4。能够直接在活体（in vivo）成像正在经历重塑的胶原蛋白，将有助于理解这些疾病的进展过程，并推动新型诊断方法和治疗手段的发展。例如，活体成像可提供有关疾病严重程度和病灶位置的信息，也可用于评估新型治疗药物的疗效。多光子激光扫描显微镜与二次谐波生成技术已被应用于在活体小鼠肿瘤中对纤维状胶原进行成像，以监测细胞外基质的重塑5。然而，该技术需要在动物身上植入透明的背侧皮肤窗室，属于侵入性操作。实现对胶原重塑的直接且非侵入性成像，将得益于一种能够特异性靶向正在重塑的胶原蛋白的探针。此类探针的制备具有挑战性，因其必须能够将处于重塑状态的胶原蛋白与正常组织中大量存在的完整且成熟的胶原蛋白区分开来6。
胶原蛋白由一种极为罕见的蛋白质结构——三螺旋结构组成，这种结构在胶原重塑过程中可被蛋白酶（如基质金属蛋白酶，MMP）切割。切割后的胶原片段失去其三螺旋结构，转变为去折叠的链状结构（明胶），随后被非特异性蛋白酶进一步降解1最近发现，具有形成三螺旋结构倾向的胶原模拟肽（CMP）能够特异性地靶向因热变性或酶降解而从其三螺旋状态解离的胶原链。1,7结合主要由单体CMP与变性胶原链之间的三螺旋杂交驱动。由于CMP在室温下会自组装成同源三聚体三螺旋，对胶原杂交的驱动力较弱，因此采用一种笼锁型CMP[(GPO)4NBGPO(GPO)4，指定为 NB（GPO）9，O：羟脯氨酸]，开发了一种含有光解性硝基苄基团（NB）的肽，该基团连接于肽链中央的甘氨酸。NB保护基团通过空间位阻阻止CMP折叠成三股螺旋结构；然而，通过紫外光照射去除保护基团后，可立即引发三股螺旋的折叠及胶原杂交1当用近红外（NIR）荧光染料标记的单体CMPs系统性地递送至模型小鼠时，可特异性靶向并实现 体内 正常组织中变性胶原蛋白的成像（例如&#160;在骨和软骨中的）和病理性的（例如&#160;在肿瘤中的重塑1.
荧光标记的CMPs也可用于成像组织学组织切片中的胶原蛋白。在组织学研究中，采集的组织通常通过固定来保存细胞成分和整体组织形态，防止其降解。固定步骤包括加热、有机溶剂处理以及化学交联试剂处理（例如&#160;多聚甲醛），使胶原的三重螺旋结构变性8。这种变性可产生供CMP杂交的位点。已有研究表明，荧光标记的CMP能够特异性结合固定组织切片中的胶原蛋白（例如&#160;皮肤、角膜和骨骼）甚至比抗胶原蛋白抗体更有效，从而能够便捷地识别纤维化肝组织中的病理状态9CMP 靶向含有三螺旋基序氨基酸序列的变性胶原链，该序列在所有类型的胶原蛋白中均普遍存在。因此，CMP 可被视为一种广谱胶原染色剂。本文中，我们提供了详细的实验操作流程 i) 成像变性胶原纤维 在体 和 ii) 可视化胶原蛋白 离体 使用荧光标记的笼状CMP进行组织切片成像。近红外荧光标记物IR680被偶联至笼状CMP用于活体成像，而羧基荧光素（CF）则因其与常规荧光显微镜的兼容性，被用于组织染色。本方案重点介绍CMP在胶原重塑相关成像中的应用。CMP的合成方法可参见先前的文献报道。1,7,9-15在本视频报告中，以正常小鼠的骨骼组织成像及小鼠角膜组织切片为例进行演示；然而，此处介绍的方法可 readily 应用于涉及胶原重塑的多种病理状况和生物学模型例如&#160;肿瘤、伤口愈合）以及几乎任何含有胶原蛋白的固定组织样本。

<table><tbody><tr><td>IRdye 680RD 马来酰亚胺（IR680）</td><td>LI-COR</td><td>929-71050</td><td>用于 CMP 标记，相关方案见其他文献&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>5(6)-羧基荧光素</td><td>Sigma</td><td>21877-5G-F</td><td>用于 CMP 标记，相关方案见其他文献&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>Advanced Chemtech</td><td>YC2200</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Butler Veterinary Supply</td><td>4/4/5260</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche Applied Science</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield 封片剂</td><td>Sigma</td><td>F6182-20ML</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>McMaster-Carr</td><td>1447T17</td><td></td></tr><tr><td>Pearl impulse 成像仪</td><td>LI-COR</td><td>9400</td><td></td></tr><tr><td>手术镊和剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyDip 玻片染色系统</td><td>Light Labs</td><td>M900-12B</td><td></td></tr><tr><td>20 位纸质显微镜玻片架</td><td>Light Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-545-c</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-E</td><td></td></tr></tbody></table>

成像变性胶原链 体内 和 离体 通过光触发笼锁胶原模拟肽的杂交

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

胶原蛋白是细胞外基质的主要结构成分，支持组织的形成与维持。尽管胶原蛋白重塑是正常组织更新的重要组成部分，但过度的重塑活动参与了肿瘤、关节炎以及许多其他病理过程。在胶原蛋白重塑过程中，细胞外环境中的蛋白酶会破坏胶原分子的三螺旋结构。此外，许多组织学组织样本中的胶原蛋白在固定和保存过程中已被部分变性。因此，这些变性的胶原链可作为生物成像的有效靶点。我们此前开发了一种笼状胶原模拟肽（CMP），可通过光触发与变性胶原链杂交，形成胶原蛋白特有的三螺旋结构。本实验方案的总体目标是 i)&#160;成像正常重塑活动产生的变性胶原纤维 体内，以及 ii) 可视化胶原蛋白 离体 使用光触发笼锁CMPs对组织切片进行杂交，以实现有效杂交和成功 体内 和 离体 成像, 荧光标记的笼状CMPs在静脉注射前立即进行光活化，或直接在组织切片上活化。本实验流程用于成像裸鼠正常骨骼胶原重塑过程以及经固定处理的小鼠角膜组织切片中的胶原。基于此处介绍的CMP-胶原杂交技术的成像方法，有助于深入理解组织重塑过程，并可促进针对高胶原重塑活性相关疾病的新型诊断方法的开发。

成像, 荧光标记, 笼状CMPs, 光活化, 静脉注射, 组织切片, 胶原重塑, 骨骼胶原, 角膜, 杂交技术, 诊断, 组织重塑

图1 显示了光触发IR680-Ahx-(GPO)的典型实验结果9 在注射后24至96小时分布于健康的雌性SKH1裸鼠体内。注射后24小时可见明显的CMP在骨骼中积聚，此时大部分未结合的肽已基本被清除。CMP与重塑的胶原纤维链杂交的过程似乎相对较慢，尤其是与其他肽类成像探针相比。例如 RGD16这很可能是因为胶原三股螺旋的折叠速率较慢17,18然而，一旦杂交完成，CMP探针即与胶原组织紧密结合，因为在杂交后24小时几乎未观察到信号减弱。图1). 在感染后96小时，剥去小鼠皮肤后的近红外荧光成像清晰显示了IR680-Ahx-(GPO)在骨骼中的摄取9 脊柱和肋骨，以及膝关节、踝关节、腕关节和下颌骨（图2A).
在 离体 组织染色，光触发的荧光标记封闭型CMPs特异性地与组织切片中变性的胶原链杂交。在 图3，CMP染色可清晰显示角膜基质中精细的平行胶原原纤维，表明其可作为特异性胶原染色剂使用。
<img alt="小鼠活体成像，荧光信号追踪，背侧-侧方-腹侧视图，24-96 小时" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 静脉注射光解封的 IR680-Ahx-(GPO)9 后，裸鼠体内连续近红外荧光成像，显示四天内骨骼摄取情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="体内成像显示CMP行为；紫外光解笼、三螺旋形成；荧光结果。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠在皮肤去除后96小时（h.p.i.）注射以下物质后的近红外（NIR）荧光图像：光解笼后的IR680-Ahx-(GPO)9（A）、未暴露于紫外光的笼蔽型IR680-Ahx-NB(GPO)9（B）、预折叠三螺旋结构[IR680-Ahx-(GPO)9]3（C），或热解离的单链IR680-Ahx-(GPO)9（D）。 CMP的骨骼靶向仅在A和D中可见。NIR荧光信号以彩虹色标显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像。</a>
<img alt="胶原基质的荧光显微镜图示，显示CMP、DAPI染色及叠加图像用于结构分析。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 小鼠角膜组织切片经戊二醛预固定后，按照方案2使用DAPI和光触发CF(GPO)9进行染色的荧光显微图像，显示致密的胶原基质（由CMP染色，绿色）以及细胞上皮层和内皮层（由DAPI染色，蓝色）（比例尺：100 µm）。

本实验流程演示了 体内 利用可光触发的笼状胶原模拟肽进行小鼠体内胶原重塑活性的近红外荧光成像，以及对组织切片中胶原的离体染色，该肽可光解后与变性胶原链杂交。

胶原蛋白是支持组织形成与维持的细胞外基质中的主要结构成分。尽管胶原蛋白重塑是一个……

以下实验的总体目标是展示通过胶原模拟肽的杂交实现体内胶原重塑活性的成像，以及体外对胶原和组织病理切片的可视化。该方法通过在紫外光照射后使封闭型胶原模拟肽折叠成三股螺旋结构，从而实现体内胶原重塑的成像。封闭型胶原模拟肽若标记近红外荧光染料（Fluor），则在静脉注射前立即通过紫外光照射激活，该过程可裂解封闭基团，促使胶原模拟肽（CMP）通过形成三股螺旋结构与胶原链杂交，用于体外组织染色。而对于固定组织切片，则可直接使用羧基荧光素标记的封闭型胶原模拟肽，在切片上进行光激活，从而促使胶原模拟肽与组织切片中存在的变性胶原链发生杂交。近红外荧光成像和荧光显微分析结果表明，CMP可在体内 remodeling 组织中靶向变性胶原链，也可用于固定组织切片，以制备用于静脉注射的光激活 CMP。首先在紫外灯预热时将其打开。用透明筒体的0.5毫升胰岛素注射器和28至30号针头，缓慢吸取新配制的近红外染料标记的笼状CMP肽溶液。仔细去除所有气泡后，将注射器直接置于紫外灯下照射五分钟，以光活化该肽。同时，将小鼠置于加热灯下的固定器中。用永久性标记笔标记尾巴，光激活后立即用70%乙醇对尾巴进行消毒。在尾巴后端的尾静脉中注射100微升肽溶液。注射后将小鼠放回笼中，以在活体中成像胶原重塑活性。首先，使用 pearl Impulse 2.0 软件将 impulse 成像仪成像床的加热板设置为 37 摄氏度。然后打开 pearl 成像仪抽屉，将一只麻醉的裸鼠放置在成像床上。将小鼠放置到位后，关闭抽屉。当仪器在成像软件面板上显示准备就绪时，勾选700通道白光和85微米选项，然后点击“采集图像”按钮。图像采集完成后，打开抽屉，旋转小鼠，并从另一个角度采集图像以获取高分辨率图像。注射后24至96小时，使用手术镊和剪刀去除小鼠皮肤，然后如前所述通过近红外荧光成像动物，获取近红外荧光图像。随后可分析图像以观察胶原和组织切片。将预先在室温下平衡的小鼠角膜切片放入湿化孵育盒中。随后在每张切片上加入 0.5 毫升封闭液，于室温孵育。孵育 30 分钟后，将切片在纸巾上轻压以去除封闭液，然后在每张组织切片上覆盖约 100 微升羧基荧光素标记的笼锁 CMP 溶液，孵育 2 分钟。在CMP溶液渗透组织的同时，预热紫外灯，然后将覆盖有CMP的组织切片暴露于紫外光下照射六分钟，以解笼封闭的CMP。紫外照射后，用一片帕拉膜覆盖每张载玻片，防止组织切片干燥，并将载玻片置于4摄氏度的湿化 chamber 中孵育两小时。CMP染色完成后，使用一对镊子轻轻移除帕拉膜。用纸巾轻压玻片以去除多余的 CMP 溶液，然后在室温下将每张组织切片浸入约 100 微升新鲜稀释的 dappy 溶液中孵育一分钟。接着，在染色缸中用 PBS 浸泡玻片，共洗涤三次，每次五分钟，每次使用新鲜的 PBS。然后向每张组织切片滴加一滴封片介质，并将盖玻片置于每张玻片上。注意避免产生气泡，将载玻片置于纸板载片盒中避光保存。最后，在荧光显微镜下观察胶原纤维。在第一组图像中，展示了光触发红外染料 IRDye 680 标记的笼状 CMP 在健康雌性 SKH-1 裸鼠体内的典型分布结果。注射后24至96小时的情况如图所示。可见注射后24小时骨骼中明显出现CMP的聚集，随后至注射后96小时，大部分未结合的肽已基本被清除。去皮小鼠的近红外荧光图像清晰显示了标记CMP的IR D six 80在脊柱、肋骨、膝关节、踝关节、腕关节以及下颌骨部位的骨骼摄取。在离体组织染色中，光触发的荧光标记笼锁型 CMP 特异性地与组织切片中变性的胶原链杂交。在这些最终图像中，CMP 染色清晰地揭示了角膜基质中精细平行排列的胶原原纤维，验证了 CMP 作为胶原特异性染色剂的适用性。基于 CMP 胶原杂交的成像方法为研究人员提供了一种研究组织重塑过程的新工具，并有望推动针对与高胶原重塑活性相关疾病（如癌症、骨质疏松症、关节炎和纤维化）的新诊断技术的开发。

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