Name: קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: למד את פרוטוקול מבחן הכיס המיקרוסקופי בקרנית עכבר לחקר אנגיוגנזה. השיטה כוללת השתלת גרגירי גורמי צמיחה וכימות כלי דם לאחר חמישה עד שישה ימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לקריסטין ג&#39;ונסון לעבודה הגרפית.

כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים מוצגים ולאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון ונערכים בהתאם להמלצותיה של האגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC). הקפד להשתמש מכשור סטרילי וtechniqure ספטית בעת ביצוע ההליך. 1 הכנת פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 10 מ&quot;ג של סוקרלפט ו60 מ&quot;ג של Hydron עם מרית ניע סטרילי. מניחים בmicrocentrifuge צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסה מרובעת 1 סנטימטר של רשת לתוך צלחת 10 סנטימטר סטרילי. היפוך כל כך רשת נשענת על מכסה רדוד. מניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של אתנול לHydron והמערבולת לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות המתאימה של גורם גדילה (סטנדרטי: 20 מיקרוגרם לbFGF, 50 מיקרוגרם לVEGF) לסוקרלפט ובקצרה מערבולת. גורם גדילת חנות ב-80 ° C מקפיא בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כרכי נוזל הוסיפו צריכים להיות מינימום של 20 μl כדי להבטיח סוקרלפט היא הרטיבה לגמרי, אבל לא יעלו על 50 μl. נפח גדול יותר הופך את האידוי של הנוזל בשלב הבא קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת סוקרלפט למאייד צנטריפוגלי על החום נמוך עד שהתערובת יבשה לחלוטין, בדרך כלל 30-50 דקות בהתאם לכמות של נוזל המשמשת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התערובת ללחות שיורית עם הקצה החד של מרית סטרילי. התערובת צריכה להרגיש &quot;פריכה&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה החד של המרית כדי לשבור את תערובת סוקרלפט בתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של Hydron לסוקרלפט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל האופי צמיג של Hydron, לחתוך את הקצה מקצה pipet 200 μl ולאחר מכן לצייר ולשחרר את 10 μl לפני pipetting למעלה שוב ומוסיף לסוקרלפט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להשתמש ירק כפוףאולא לערבב Hydron וסוקרלפט ומסירים מצינור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את התערובת בצד התחתון של הקצה של המרית הכפופה ולאחר מכן לסובב את הצינור בעת הציור את המרית לאורך הקיר של הצינור. התערובת תתייבש במהירות כל כך חייב להיעשות צעד זה ביעילות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את התערובת על גבי הרשת מוכנה באמצעות מלקחיים כדי להחזיקו במקום. התערובת צריכה להיות גם שכבה ולמלא לתוך החורים של הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המרית הכפופה לHydron הצינור המכיל ולהשתמש בו מעיל משני צידי הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשת המצופה נשענת על צד נגד קצה הצלחת ולאפשר ייבוש ב RT עבור 30-45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשת במקפיא -20 ° C או פנה מייד לשלב הבא. שמור רשת בתוך צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 35 מ&quot;מ בתוך צלחת פטרי הגדולה יותר, המכסה. השתמש בזוג המלקחיים למשוך בזהירות את הסיבים של הרשת בנפרד על צלחת 35 מ&quot;מ. ג כדורים תועיםייגבה מהצלחת הגדולה יותר בסוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו כדורים לאחידות בהיקף. תהליך התשואה של כ 250 כדורים ובכך המינון הסטנדרטי לגלולה לbFGF וVEGF הוא 80 ng ו200 ng, בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי חנות ב35 צלחת מ&quot;מ במקפיא -20 ° C עד 3 חודשים. </li></ol> .2 השתלה כירורגית של פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אזור ניתוח תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם Avertin (400-500 מ&quot;ג / קילוגרם, intraperitoneal) ומקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ כך עין גלויה. בצע קמצוץ הבוהן כדי להבטיח רמה מספקת של הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העין העכבר על ידי הצבת 1 טיפה של פתרון proparacaine על גבי גלגל העין. חכה 20-30 שניות ולהספיג עם תחבושת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proptose עין העכבר עם # הקהה להיות בטוח לעזוב את העור בין מלקחיים ועין 1 מלקחיים תכשיטנים. חשוב לשפוט את הלחץ המופעל בצורה נכונה.60; מחזיק את העין בחוזקה מדי יגרום לו להיות אדום ומגורה, ואילו מדי לאבד את האחיזה תאפשר עין לנוע במהלך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בmicroknife 30 ° לעשות חתך לתוך הקרנית כ 1 מ&quot;מ מימבוס. החתך צריך להיות 1-2 מ&quot;מ אורך. חתך צריך להיות עמוק מספיק כדי לחדור מעבר לשכבת האפיתל לmidstroma אבל לא כל כך עמוק כדי לקרוע את העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין פון GRAEF לעשות כיס בניצב לחתך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את הסכין מתחת לשכבה הקרנית באתר החתך ובעדינות לעבוד סכין ובהעבר אותו לאורך החתך להגדלת החלל, ובכך ליצור הכיס. זה עוזר להזיז את העכבר, כמו גם להיות מסוגל לעבוד עם העקמומיות של העין. היזהר שלא לדחוף כלפי מטה עם הקצה כדי למנוע פקיעת עין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב המלקחיים של צורף # 5 עם proparacaine לקחת גלולה עד מתוך צלחת. מניחים גלולה על העין. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את סכין פון GRAEF עם proparacaine ולהעביר חלק מנוזל על גלולה כדי להפוך אותו גומי וגמיש. להסיר לחות עודפת עם תחבושת או מטלית כותנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הכדור לתוך הכיס באמצעות סכין פון GRAEF לדחוף אותו פנימה מתחת לשכבת הקרנית. ברגע שכל גלולה היא בפנים, להפעיל את הצד השטוח של סכין פון GRAEF על אתר כדי לבדוק שהגלולה היא מאובטחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עין עם משחה אנטיביוטית משולשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפכתי את העכבר ולחזור על ניתוח בעין השנייה. </li></ol> .3 כימות של הקרנית neovascularization. השאר בעלי חיים כדי לפתח כלי מעל פרק זמן מוגדר. היום לדירוג כלי תלוי בגורם גדילה בשימוש. הכיתה bFGF ביום 5 וVEGF חלש יותר ביום .6 יום ההשתלה הוא יום 0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם Avertin (400-500 מ&quot;ג / קילוגרם, intraperitoneal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ מנורת הסדק להגר&quot;אדינג. יש עינית אחת reticule, קווים בתוך העינית משמשת ככולים עזר למדידה לכמת אונייה שאורכה ומרחק סביב ההיקף של העין שהכולים צצו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העכבר מול היקף, מיקום עכבר ולכן העין נראית בעיניים עם גלולה ישירות קדימה. לייצב את הראש בין האגודל לאצבע ולכן העור מתהדק על פנים והעין proptosed מעט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ציר y של reticule לאורך כלי limbal ישירות מתחת גלולה. מדוד את האורך של כלי הסתעפות כלפי מעלה לכיוון כדורים. להקליט מדידה זו בעשירית מילימטרים ולייעד אונייה שאורכה (VL) (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל או העכבר או ארנק, כך שהמרחק סביב העין שהכלים האלה צצו מתבהר. זה הכי קל לחשוב על עין כפני שעון במרווחים של 1 עד 12. מיועד שעת שעון מספר זה (CH) (איור 1B). זה יכול להיות מספר או שברים של 0.25 (למשל, 2, 2.25, 2.5 או 2.75) שלמים. הערה: CH הוא סובייקטיבי. לדוגמא, חלקם עשוי למדוד את המרחק סביב העין שיכלול את כל נבטו מימבוס ואילו אחרים עשויים להפסיק מדידה בנקודה שבי האונייה שאורכה הוא מחצית מקסימלי כלי. הגורם החשוב הוא להיות עקבי עם איך אחד בוחר לכיתה. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> איור 1 כימות neovascularization קרנית. () 80 ng bFGF גלולה הושתלה בעכבר / 6J C57BL מראה מנורת סדק reticule אוריינטציה למדוד אונייה שאורכה. VL = 0.9 מ&quot;מ. (ב) reticule מנורת הסדק מראה עין אותו מסובב למדוד שעת שעון. CH = 3.25. אזור ספינה מחושב = 1.84 מ&quot;מ 2. תמונות אלה שופרו באופן דיגיטלי על מנת לאפשר לתוספת של סכמטי reticule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שטח הכלי (VA) תוך שימוש בנוסחה הבאה, המבוסס על השטח של סגלגל (הערה, זה עוזר לשמור את זה בחשבון בעת ​​דירוג.) אקספרס VA במילימטרים בריבוע. הנוסחה היא כדלקמן: שעת x 0.2 π = אזור כלי שעון Vessel אורך X </li></ol>

<ol><li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells%3A+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li>
<li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-promoting+phorbol+esters+induce+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro.</a> Cell. 42, 469-477 (1985).</li>
<li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).</li>
<li>Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histotypic+angiogenesis+in+vitro%3A+light+microscopic%2C+ultrastructural%2C+and+radioautographic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies.</a> In Vitro. 18, 538-549 (1982).</li>
<li>Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).</li>
<li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit%27s+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).</li>
<li>Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+angiogenesis+assays%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative angiogenesis assays: progress and problems.</a> Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+in+vivo+by+prevention+of+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization.</a> J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+growth+and+neovascularization%3A+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li>
<li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li>
<li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li>
<li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li>
<li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Comp%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li>
<li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר צעדים קריטיים בביצוע assay קרנית מוצלח. הוא עושה הראשון כדורים אחידים אפשר להשתיל ומגרים כלי. החלקים החשובים ביותר של הכנת גלולה הם 1) שימוש בגורם גדילה ללא ספק; 2) להבטיח תערובת טובה של גורם גדילה עם סוקרלפט וHydron ו3) נע התערובת הסופית במהירות אבל בזהירות מצינור Eppendorf לרשת שבו כדורים נוצקו. מומלץ כי כדורים &quot;דמה&quot; נעשים ללא גורם גדילה לתרגל את הטכניקה. פלטות אמורות להופיע לבנה וגיר ולהיות בערך מרובע בצורה. כל כדורים שכוללים אזורים ברורים צריכים להיות שלילי...

התהליך של אנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים בצורה קודמת נותרים אלה, הוא מורכב מאוד והוא מוסדר על ידי מספר גורמים במשק ששולטים בצעדים שונים של הנבטה הכלי והמורפוגנזה. אנגיוגנזה מופעלת עקב שינוי באיזון בין גורמים בעד ונגד אנגיוגנזה, איזון, כי בדרך כלל שומר על כלי הדם במצב שקט. אנגיוגנזה במבוגרים מתרחשת בתנאים מסוימים פיסיולוגיים כמו במהלך מחזור השחלות הנקבה או בתהליכי תיקון כגון ריפוי פצעים והתחדשות רקמות. עם זאת, זה גם סימן היכר של כמה פתולוגיות הכוללים גידולים ממאירים, מחלות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. המעורבות של אנגיוגנזה בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים אלה הופכת אותו לנושא חשוב למחקר וליעד אטרקטיבי לטיפול. בשל המורכבות של אנגיוגנזה ומעורבותם של כמה ceLLS וגורמים בתהליך, כוללים תאים אנדותל, pericytes, תאים במחזור ותאי סטרומה, במודלים חוץ גופית יישארו מוגבלים ולא יכולים לשחזר את microenvironment הייחודי in vivo. העיקרי במבחני חוץ גופית של אנגיוגנזה מתמקדים במידה רבה בהתבוננות השפעות ישירות על תאי האנדותל ומדידת צעדים מסוימים בתהליך angiogenic בתנאים מבוקרים. מבחני אלה כוללים את הכימות של תא האנדותל התפשטות 1, הגירה 2, היווצרות רשת 3, היווצרות צינור 4 ומבצבצות spheroids 5. דגמי Ex vivo, שלא כמו במבחנה אלה, הם מורכבים יותר ולשלב סוגים שונים של תאי רקמה, דוגמא ש assay טבעת אב העורקים 6. עם זאת, כמו מערכות אחרות, זה לא יכול ללכוד את תרומתם של תאים במחזור וסטרומה הטבעית של תאי האנדותל כקיים בגוף חי. ניסיונותללמוד אנגיוגנזה תחת זרימה לחקות את הגדרת in vivo מבוצעים באמצעות מערכות microfluidic 7, אפילו אולם מבחני אלה, למרות שהשתפר מאוד, עדיין לא מצליחין להסביר את כל התאים קיימים בגוף חי. בשל המגבלות של במבחנה ולשעבר מודלים אנגיוגנזה vivo, in vivo מודלים יישארו הבחירות אמינות יותר ללימודי אנגיוגנזה. דוגמאות למודלים אלה כוללים השתלה של תאים שקופים, &quot;חלונות&quot;, המאפשרים ההדמיה של כלי דם גדלו תחת מיקרוסקופ 8, CAM שתלים תת עורית בהזרקה כגון היווצרות matrigel וכלי ברקמות נורמליות כמו אוזן עכבר וקרום chorioallantoic העוף ( ). עם זאת, אחד מדגמי אנגיוגנזה in vivo המקובלים וכמותיים ביותר הוא assay קרנית neovascularization micropocket המתואר כאן, המנצל את באופן טבעי avascularקרנית כ&quot; מסך &quot;כדי לחזות ולהעריך צמיחת angiogenic חדשה 9. כאן אנו מתארים את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים. בתחילה המודל המשמש למדידת גירויי angiogenic ספציפיים בקרניות ארנב. הדבר נעשה על ידי החדרת חתיכות גידול לתוך ההומור המימית של הלשכה הקדמית של העין הארנב ונמדד neovascularization מושרה גידול 11. עם זאת, assay מאוחר יותר התפתח לחוקר את ההשפעות של גידול ספציפי גורמי 10 לציין טוב יותר ולתקנן את השפעת angiogenic. על מנת לשחרר את גורם הגדילה בעיניים, כדורים בשחרור איטי המכילים כמויות ידועות של גורמי גדילת angiogenic שמשו במקום רקמות. הזמינות של חלבוני angiogenic רקומביננטי מטוהרים כגון bFGF או VEGF אפשרה את השימוש בם כמטרות ספציפיות של modulaters אנגיוגנזה 12. בתחילה, assay היהמשמש בעיקר בארנבות, שהם קלים יותר לעבוד עם בשל גודלם, אך מאוחר יותר המודל תורגם לעכברים; מודל חיה קטן יותר ופחות יקר. עובר מארנב לעכברים סיפק יתרון חשוב של להיות מסוגל להשתמש בבעלי חיים מניפולציות גנטיים, ובכך ליצור תחום חדש של מחקר למרכיבים הגנטיים המשפיעים על היווצרות כלי דם 13. בנוסף לשימוש מקובל יותר של assay קרנית בלימוד אנגיוגנזה, תהליכים ביולוגיים אחרים יכולים גם נחקר באמצעות מבחני שונה. לדוגמא, מחקרים של lymphangiogenesis התאפשרו באמצעות ההשתלה של כדורים במינון bFGF נמוכים שאפשרו להדמיה של כלי הלימפה דרך סמנים מולקולריים ספציפיים 14. בנוסף, assay זה סיפק אמצעי כדי להעריך את ההשפעות של קרינה על אנגיוגנזה 15. לסיכום, assay אנגיוגנזה micropocket הקרנית הוא כמותי, נציגroducible, הערכה גמישה של אנגיוגנזה in vivo. יתרון עיקרי של assay זה הוא שהמדידה של כלי רקע היא מיותרת, משום שהכולים גדלים על רקמות באופן טבעי avascular. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול של assay זה בפרטים ולדון בתרחישים שונים שיכול להתרחש. Assay כולל 3 מקטעים בדידים. כאן אנו מתארים את ההכנה של כדורי גורם כלול צמיחה, השתלה כירורגית שלאחר מכן ולבסוף שיטה לכמת את צמיחת neovascular וכתוצאה מכך.

<table><tbody><tr><td>סעיף 1: הכנת</td><td></td><td></td><td></td>גלולה</tr><tr><td>Sucralfate</td><td>Sigma</td><td>#S0652</td><td></td></tr><tr><td>Hydron (aka Poly(2-Hema))</td><td>Sigma</td><td>#P3932-10G</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco Products Inc</td><td>#111000200CSGL</td><td></td></tr><tr><td>גורמי גדילה:</td><td></td><td></td> <td>חייבים להיות ללא נשא (ללא אלבומין בסרום בקר (BSA))</td></tr><tr><td>&nbsp; גורם גדילה פיברובלסטי (FGF)</td><td>PeproTech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF)</td><td>R D Systems</td><td>#293-VE-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ</td><td>Becton-Dickson</td><td>#353001</td><td>משמש לאחסון כדורים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ</td><td>VWR</td><td>#25384-342</td><td>משמש כמשטח עבודה להכנת כדורים</td></tr><tr><td>רשת</td><td>ספר אמריקה</td><td>#03--300/51</td><td>ניילון ניטקס 300 אום, חתוך לחתיכות מרובעות ס"מ ומעוקר במרית חיטוי</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td> <td>#21-401-10</td><td>השתמש בקצה מחודד של אחד כדי לפרק את תערובת הגלולות. כופפו קצה מחודד של אחר כדי לסייע בהסרת התערובת מצינור המיקרו-צנטריפוגה.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>#05-408-146</td><td>אחד להידרון, אחד למלקחיים של תכשיטנים סוקרלפט,</td></tr><tr><td>#5</td><td>אמבלר כירורגי#2315E</td><td></td> <td>צריך 2 לפירוק רשת</td></tr><tr><td>מאייד צנטריפוגלי</td><td>ThermoSavant</td><td>DNA110 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סעיף 2: השתלה כירורגית של כדורים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפעלה</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% Avertin</td><td></td><td></td><td>הרדמה כללית</td></tr><tr><td>תמיסת עיניים Proparacaine hydrochloride 0.5%</td> <td>Falcon</td><td>NDC# 6131401601</td><td>הרדמת עיניים</td></tr><tr><td>משחת עיניים אנטיביוטיקה משולשת</td><td>Bausch Lomb</td><td>NDC# 2420878055</td><td>מכיל ניאומיצין, פולימיקסין ובציטראצין</td></tr><tr><td>מיקרו-סכין עיניים, 5 מ"מ</td><td>Surgistar</td><td>#924501</td> סכין פון גראף <td>בזווית של 30 מעלות</td></tr><tr><td></td><td>אמבלר כירורגי</td><td>#3401E</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים תכשיטנים, #1</td><td>אמבלר כירורגי</td><td>#2301E</td><td>יש להקהות באבן השחזה לתמיכה</td></tr><tr><td>במלקחיים של תכשיטנים בעיניים, #5</td><td>אמבלר כירורגי</td><td>#2305E</td><td>לאיסוף כדורים והנחת מספריים מעוקלים קטנים על העין</td></tr><tr><td></td><td>אמבלר כירורגי#5636E</td><td></td><td>לקיצוץ שפם</td></tr><tr><td>גזה</td><td></td><td></td><td>לכתמים בעין לאחר פרופרקאין</td></tr><tr><td>סעיף 3: דירוג של קרנית Neovascularization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% Avertin</td><td></td><td></td><td>מנורת חריץ בהרדמה כללית</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>FS-2</td><td>זקוק לעין עם רשת כדי לסייע במדידה</td></tr></tbody></table>

קרנית micropocket assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Assay micropocket קרנית העכבר הוא assay חזק וכמותיים in vivo להערכת אנגיוגנזה. על ידי שימוש בכדורים בשחרור איטי סטנדרטיים המכילים גורמי גדילה ספציפיים שמעוררים צמיחת כלי דם בכל הקרנית באופן טבעי avascular, אנגיוגנזה ניתן למדוד ולכמת. ב assay זה התגובה angiogenic נוצרה במהלך כמה ימים, תלוי בסוג והמינון של גורם גדילה בשימוש. האינדוקציה של neovascularization מופעלת בדרך כלל על ידי או גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF) או גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF). על ידי שילוב של הגורמים הללו צמיחה עם סוקרלפט וHydron (פולי המו (פולי (methacrylate 2-Hydroxyethyl))) וליהוק התערובת לתוך כדורים, הם יכולים להיות מושתלים בניתוח בעין העכבר. כדורים אחידים אלה לאט-לשחרר גורמי גדילה על פני חמישה או שישה ימים (bFGF או VEGF בהתאמה) המאפשרים תגובת angiogenic מספיקה הנדרשת לq אזור הספינהuantification באמצעות מנורת סדק. assay זה יכול לשמש ליישומים שונים, כוללים ההערכה של תרופות angiogenic מאפנן או טיפולים, כמו גם השוואה בין רקע גנטי שונה המשפיע על היווצרות כלי דם. חוקר מיומן לאחר תרגול assay זה יכול להשתיל גלולה בפחות מ -5 דקות לכל עין.

תוצאות אופייניות לכדורי bFGF וVEGF בC57BL / 6J angiogenic הנמוך הנורמלי מוצגות באיור 2 א &#39;וב&#39;, בהתאמה. 2E איור מציג את ההתפלגות הנורמלית של אזור הספינה (VA) בC57BL / מתח 6J עם מינונים שונים של הצמיחה הבאות גורמים. 80 כדורי bFGF ng בדרך כלל לגרום לVA של כ 2.0 2 מ&quot;מ, אם כי ערכים בטווח של 1.8-2.4 2 מ&quot;מ מקובלים. 200 כדורי VEGF ng בדרך כלל לגרום לתגובה של כ 0.7 2 מ&quot;מ, עם מגוון רחב של ערכים המקובלי...

הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעורר צמיחה של כלי דם בקרנית העכבר. הדבר מושג תחילה על ידי הכנת כדוריות המכילות גורם גדילה. השלב השני הוא ביצוע השתלה כירורגית של כדורית לתוך הקרנית.לאחר מכן משאיריים את העכברים למשך חמישה עד שישה ימים, בהתאם לגורם הגדילה, כדי לאפשר התפתחות של כלי דם. השלב הסופי הוא כימות שטח כלי הדם, תוך שימוש במיקרוסקופ ספליט-למפ (slit lamp) למדידת אורך ממוצע של כלי הדם והמרחק מסביב להיקף העין שאליו צמחו כלי הדם. בסופו של דבר, בדיקת מיקרו-כיס בקרנית משמשת כשיטה הניתנת לשחזור ואמינה למחקר של אנגיוגנזה in vivo.באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בביצועה בשל אופיה הרגיש מבחינה טכנית של הפרוצדורה. על החוקרים לצפות לצורך בתרגול נרחב לפני הניסויים המעשיים כדי להבטיח עקביות הן בטכניקות הכירורגיות והן בטכניקות הדירוג. התחילו את הכנת הכדורית על ידי שקילה של 10 milligrams של suc fate ו-60 milligrams של hydron באמצעות שפכטל סטרילי לא כפוף, והניחו אותם בנבובות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות.הניחו פיסה ריבועית של רשת ניילון בגודל סנטימטר אחד בתוך צלחת סטרילית של 10 סנטימטרים. הפכו אותה כך שהרשת תנוח על המכסה הרדוד והניחו אותה בצד. לאחר מכן, הוסיפו 500 microliters של אתנול להידרון וערבבו במערבל וורטקס למשך 10 דקות לפחות.הוצאו מבחנה של גורם גדילה מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעל

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקרנית היא ייחודית בכך שהיא חסרה רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי דם חזקים צמיחה והישרדות יכול להיגרם על הקרנית על ידי גורמים angiogenic עוצמה. לכן, הקרנית יכול לספק לנו עם כלי רב ערך עבור מחקרים angiogenic. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את המודל של העכבר assay הקרנית כיס וכיצד להעריך את אנגיוגנזה המושרית על ידי גורמים angiogenic באמצעות המודל הזה.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל ex vivo של הנבטה כורואידית לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית. הבדיקה כוללת תרבית של צמחי עין עכבר המכילים את רקמת הכורואיד המחוברת ללובן העין ולאפיתל פיגמנט הרשתית בתנאים ספציפיים המקדמים הנבטה מיקרו-וסקולרית כורואידית.

בדיקת הנבטת כורואיד לחקר התפשטות כלי דם עיניים Ex Vivo

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Neovascularization (NV) של הקרנית יכול לסבך פתולוגיות חזותיות מרובות. ניצול מודל פציעה מבוקרת, אלקלי צריבה, רמת כימות של NV בקרנית יכולה להיות מיוצרת למחקר מכניסטית של NV והערכה של קרנית של טיפולי פוטנציאל להפרעות neovascular.

פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הניאו-וסקולריזציה הכורואידלית (CNV) המושרה על ידי לייזר עכבר, מודל ניסיוני המשחזר את סימני ההיכר של כלי הדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל ניאו-וסקולרי (AMD). לאחר שליטה, הוא יכול לגרום באופן אמין ויעיל ל-CNV כמערכת מודל לבדיקת אמצעים ניסיוניים שונים.

מודל עכבר לneovascularization Choroidal מושרה לייזר

כאן, אנו מציגים את התועלת של האורך ויוו הדמיה מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית בעכברים.

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

פרוטוקול זה מתמקד בניאו-וסקולריזציה של הקרנית הנגרמת על ידי כוויות אלקליות בעכברים. השיטה מייצרת מודל למחלות קרנית הניתנות לשחזור ולשליטה כדי לחקור אנגיוגנזה פתולוגית ואת המנגנונים המולקולריים הקשורים ולבדוק סוכנים פרמקולוגיים חדשים למניעת ניאו-וסקולריזציה של הקרנית.

מודל עכבר לניאו-וסקולריזציה של הקרנית על ידי כוויה אלקלית

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

למד את פרוטוקול מבחן הכיס המיקרוסקופי בקרנית עכבר לחקר אנגיוגנזה. השיטה כוללת השתלת גרגירי גורמי צמיחה וכימות כלי דם לאחר חמישה עד שישה ימים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

גלה סרטונים נוספים