Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da Trichoderma reesei In piante di tabacco

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esprimere le proteine bersaglio in modo transitorio nel tabacco per ottenere un'idea della fattibilità dell'espressione enzimatica a base vegetale in un breve lasso di tempo. Questa espressione transitoria si ottiene infiltrando le foglie di tabacco con un ceppo di agrobacterium tumor fain, che contiene un vettore che incorpora il gene di interesse come secondo passaggio Dopo l'incubazione, le foglie infiltrate vengono raccolte e gli estratti proteici vengono parzialmente purificati per ottenere una soluzione enzimatica funzionante. Successivamente viene eseguita l'analisi delle proteine al fine di valutare gli effetti dell'espressione vegetale sull'enzima e di verificarne l'attività enzimatica.

Si ottengono risultati che mostrano le dimensioni delle proteine, i possibili effetti della glicosilazione e l'attività enzimatica sulla base di saggi di western blotting, zy e degradazione del substrato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla conversione della biomassa vegetale e può anche fornire informazioni sull'attività degli enzimi dopo essere stati espressi transitoriamente nel tabacco. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di infiltrazione sono difficili da imparare a causa delle foglie che vengono facilmente danneggiate dai vestiti della siringa e eseguirò gli esperimenti in condizioni sterili.

Trasferire singole colonie di agrobacterium toan in un pallone di erlenmeyer contenente 10 millilitri. Brodo di estratto di lievito con antibiotici. Quindi, incubare il brodo inoculato per 36-40 ore a 26 gradi Celsius con 180 giri/min, agitando, quindi inoculare 200 microlitri di ciascuna coltura in 20 millilitri di brodo di estratto di lievito con gli stessi antibiotici di prima e incubare nelle stesse condizioni dopo 36-40 ore.

Indurre le colture con due microlitri di acetofenone, 100 microlitri di soluzione di glucosio al 40% e 200 microlitri di un tampone MES molare a pH 5,6 e continuare a incubare durante la notte. Ora prendi le piante dalla serra e usa la punta di una pipetta per intaccare il lato assiale AB della terza e della quinta foglia dalla parte superiore della pianta per facilitare l'infiltrazione. Quindi riempire una siringa con mezzo di infiltrazione e posizionarla su una delle tacche precedentemente realizzate.

Sostenere la siringa con un dito sul lato dell'assio fogliare e iniettare con cautela il terreno nella zona della foglia per via endovenosa. Per visualizzare la fluorescenza nelle sezioni fogliari che esprimono la cellula TR 5:00 AM, fai brillare le piante con una fonte di luce portatile che emette luce verde. Se osservata attraverso un filtro rosso, la fluorescenza della cella TR delle 5:00 AM cherry sarà chiaramente visibile.

Per estrarre le proteine espresse, selezionare le foglie di tabacco che sono state infiltrate con AUM contenente P traccia la cellula ERTR cinque A e tagliarle in pezzi da un grammo. Quindi, metterli in un mortaio pre-raffreddato e aggiungere una quantità adeguata di azoto liquido ai campioni. Macina le foglie in polvere usando un pestello.

Ripetere il processo con foglie di tabacco non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Quindi aggiungere due millilitri di PBS contenente un millimolare di fluoruro di fenil metil suen alla materia fogliare macinata e mescolare fino a quando la maggior parte della materia fogliare è in sospensione. Centrifugare l'estratto a 15.000 GS per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi scartare la cellula TR 5 A parzialmente purificata in pellet incubando la proteina contenente S natin a 55 gradi Celsius per 10 minuti e lasciarla riposare a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Quindi centrifugare uno SNAT a 15.000 GS per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il pellet e utilizzare la proteina contenente snat per tutti.

Ulteriori saggi. Eseguire anche il processo di purificazione parziale per piante non infiltrate per ottenere campioni di controllo. In questa procedura, mescolare etilcellulosa e acqua per ottenere una soluzione all'1,5% e incubare agitando fino a quando non si sarà sciolto.

Per fare A-C-M-C-S-D-S page gel sostituire un millilitro di CMC all'1,5% con un millilitro di acqua in una soluzione di miscela di gel per pagina SDS da 10 millilitri e versare il gel normalmente dopo, denaturare i campioni facendoli bollire in presenza di SDS. Eseguire l'elettroforesi a 200 volt per 50 minuti fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. Ora eseguire il ripiegamento delle proteine in gel sul punto 15% C-M-C-S-D-S pagina gel.

Utilizzando l'1,5% di beta ciclodestrina in tampone citrato fosfato da 20 millimolari a pH 6,5. Incubare il gel in questa soluzione a temperatura ambiente agitando delicatamente per 15 minuti. Scartare la soluzione di beta ciclodestrina e lavare brevemente il gel con acqua incubata a temperatura ambiente in tampone di acetato di sodio da 50 millimolari a pH 4,8 per altri 15 minuti.

Quindi eseguire la CMC zy utilizzando il gel di pagina 15%C-M-C-S-D-S a punta ripiegata incubando il gel in tampone di acetato di sodio da 30 millimolari per 20 minuti a 50 gradi Celsius. Per visualizzare dove la CMC si è degradata, colorare il gel per 10 minuti utilizzando una soluzione di rosso Congo allo 0,1% e trattenerlo con un molare di cloruro di sodio per 30 minuti o fino a quando non si osservano bande chiare alla fine, lavare il gel con acido acetico allo 0,3%. Per ottenere un imaging più chiaro, immediatamente prima di eseguire il test, preparare una pipetta con quattro MUC e due X di soluzione di lavoro con 100 microlitri di quattro MUC in pozzetti separati di una piastra da 96 pozzetti.

Quindi aggiungere 100 microlitri di ciascun campione nei pozzetti appropriati, eseguendo ogni campione in triplicato utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nanometri. Determinare il punto temporale al minuto zero di quattro fluorescenze mu attraverso la spettroscopia fluorescente. Quindi, incubare le piastre coperte con coperchi adesivi a 50 gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, arrestare la reazione congelandola. Successivamente, misurare la fluorescenza mu del punto finale utilizzando gli stessi parametri del punto temporale del minuto zero. Sottrarre il valore di fluorescenza al minuto zero dal valore di fluorescenza a 20 minuti per determinare la variazione della fluorescenza causata dall'attività enzimatica immediatamente prima dell'esecuzione del saggio.

Preparare la soluzione di lavoro A-O-C-M-C two X. Quindi unire 50 microlitri di campione e 50 microlitri di soluzione di lavoro in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, incubare i campioni per 20 minuti a 50 gradi Celsius.

Arrestare la reazione aggiungendo 250 microlitri di soluzione di precipitazione. Successivamente, agitare energicamente ogni campione per 10 secondi per garantire la completa miscelazione del campione con la soluzione di precipitazione. Quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti e agitarli nuovamente prima di centrifugarli a 1000 Gs per 10 minuti.

Dopodiché trasferire 200 microlitri di SNAT da ciascun campione a una piastra a 96 pozzetti senza disturbare. L'attività enzimatica del pellet è dimostrata da livelli più elevati di colorante solubilizzato. Misuralo utilizzando la spettroscopia assorbente a una lunghezza d'onda di 590 nanometri.

In questo passaggio. Metti i cerchi di carta da filtro in tubi da 1,5 o due millilitri. Aggiungere 100 microlitri di acetato di sodio da 60 millimolari e 100 microlitri di campioni ai cerchi di carta da filtro e incubare per 20 ore a 50 gradi Celsius con agitazione a 300 giri/min.

Inoltre, incubare i singoli campioni senza carta da filtro come controlli immediatamente prima di eseguire il saggio. Preparare una soluzione di lavoro 1,5 x PABA contenente un millilitro di soluzione di PBA A e nove millilitri di soluzione di PABA B.Store ghiaccio fino all'uso. Successivamente, preparare i campioni in provette termostabili da 0,5 millilitri.

I campioni sono composti da 45 microlitri di acqua, cinque microlitri di ciascuna soluzione incubata con carta da filtro e 100 microlitri di soluzione di lavoro PABA. Successivamente, esegui i controlli a campione e cinque standard preparati allo stesso modo. Quindi incubare i campioni, i controlli e gli standard per esattamente 10 minuti a 100 gradi Celsius e raffreddare a temperatura ambiente per altri 10 minuti.

Pipettare 100 microlitri della soluzione in una piastra a 96 pozzetti, un saggio con uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 410 nanometri. Sottrarre i valori di controllo del singolo campione dai valori del campione della carta da filtro per determinare la quantità di zuccheri riducenti rilasciati. Ecco un'immagine che mostra le cassette di espressione e l'espressione proteica nelle piante di tabacco.

Ecco come appare una foglia di tabacco infiltrata alla luce normale e alla luce verde con un filtro rosso dove l'espressione della cellula TR 5:00 AM cherry indicata dal colore rosso è chiaramente visibile qui. La pagina SDS gel western lot e CMC zy che mostrano le dimensioni e l'attività della cellula T cinque A.Le proteine solubili totali sono state separate e possiamo visualizzarle con la colorazione blu kumasi Western blotting contro la regione del tag hist della cellula T cinque A conferma la dimensione della proteina e inoltre l'attività della cellulasi contro CMC è mostrata da uno xenotrapianto colorato con rosso Congo. Ciò che si può vedere qui sono le proteine solubili totali dalle foglie della pianta di tabacco, dove la cellula TR cinque A è stata espressa transitoriamente prima e dopo la purificazione per precipitazione termica, dove la cellula TR cinque A è la banda visibile più grande ed è visibile anche nel lotto occidentale e nell'igrafo delle CMC.

Vediamo anche le proteine solubili totali delle piante di tabacco dove la Tcell 5 A non si trovava anche dopo la precipitazione termica e le proteine di una miscela di tresa cellulasi disponibile in commercio. Questa figura mostra la quantificazione dell'attività enzimatica della cellula TR cinque Una cellula TR cinque A è stata incubata con quattro MUC Azo CMC o carta da filtro e la degradazione del substrato è stata misurata mediante il rilascio del fluoro quattro quattro mu il colorante azoico o quantificando gli zuccheri riducenti dal cambiamento di colore del PBA Seguendo questa procedura. Altri metodi, come il targeting proteico, possono essere utilizzati per fornire ulteriori informazioni su come la localizzazione delle proteine può influenzare la stabilità e l'attività dell'enzima.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una chiara comprensione di come esprimere transitoriamente le proteine nel tabacco e alcune buone conoscenze su come valutare l'attività enzimatica. Conversione della biomassa cellulosica Foro.