הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לשתק את המבנים התאיים של תאי הצמח על ידי החלפת לחץ גבוה, הקפאה והקפאה מהירה להדמיה לאחר מכן על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. זה מושג על ידי הכנה קפדנית של דגימת רקמה להקפאה על ידי קידודה עם חומר הקפאה כדי להבטיח שהרקמה תיפגע באופן מינימלי במהלך הקפאה בלחץ גבוה. כשלב שני, הדגימה מוקפאת במהירות בלחץ גבוה, מה שמשתק את מרכיבי התא ומגביל את היווצרות הקרח הגביש, וכתוצאה מכך תאים עם מורפולוגיה שלמה.

לאחר מכן מתבצעת החלפה חופשית מהירה על מנת להחליף את המים התאיים בממיסים אורגניים ולהכניס מקבעים כגון אוסמיום טטרוקסיד, ובכך לקשר ולייצב מבני אולטרה תאיים. מתקבלות תוצאות המראות הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה מהירה משמרים ביעילות את המבנים התאיים של הצמח ואת המורפולוגיה המבוססת על מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו קיבוע כימי קונבנציונלי הוא ש-H-P-F-Q-F-S משתק את התוכן התאי באלפיות שנייה וממזער את היווצרות החפצים.

בדרך כלל, פרוטוקול QFS מאתגר למתחילים, ולכן מומלץ ששני אנשים יעבדו יחד עד שהמשתמשים ירגישו בנוח עם ההליך. יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי, כולל כפפות קריו ומשקפי מגן, בעת טיפול בחנקן נוזלי מלאו קופסה מבודדת המכילה מחזיקי בקבוקון קריו בחנקן נוזלי כך שהמחזיקים יהיו מכוסים לחלוטין. השימוש המקבע במהלך החלפת הקפאה מהירה או QFS הוא 1% אוסמיום, טטרוקסיד ו-0.1% אצטט משתנה באצטון.

לאחר הכנת נפח גדול של התמיסה בהתאם לכל אזהרות הבטיחות, כמויות של 1.5 מיליליטר מוזרמות לבקבוקוני קריו ומאוחסנות קפואות בחנקן נוזלי. הנח את המספר המתאים של בקבוקוני קריו מסומנים המכילים תחליף הקפאה או מדיום FS לתוך האלומיניום, שני מחזיקים בחנקן הנוזלי. עם פרוטוקול זה ניתן להניח עד ארבעה דיסקים שכל אחד מהם מכיל דגימה בודדת בבקבוקון יחיד כשעה עד שעה וחצי לפני הכנת הדגימה.

יש להפעיל את המקפיא בלחץ גבוה ולהכין אותו לריצה. פרוטוקול זה דורש גם משחת שמרים כחומר קריאופרוטקט חוץ-תאי למילוי החלל סביב הדגימה. במנשא הדגימה מערבבים מעט שמרי אופה בנפח שווה בערך של 10% מתנול בעזרת קיסם עד שהעיסה חלקה.

עם עקביות של תערובת פנקייק, כמות הדבק הדרושה תלויה במספר הדגימות עבור 10 דגימות או פחות, ניתן לערבב את הדבק בצינור מיקרו צנטריפוגה. להכנת דגימה להקפאה בלחץ גבוה או HPF, הסר עלה מעניין מהצמח והניח אותו בעדינות על פיסת שעווה דנטלית או משטח חיתוך אחר. השתמש באגרוף של 0.2 מילימטר כדי לחתוך דגימה מהעלה.

החלק הקריטי ביותר בהליך זה הוא הכנת דגימה זו להעמסה לתוך מנשא דגימה זה. אם הדגימה מטופלת בצורה גרועה, שום צעד אחר לא יפדה את עלות הנזק עבודה תחת מיקרוסקופ מנתח. מצא את הצד של 0.2 מילימטר של מנשא הדגימה מסוג A וצפה אותו במשחת שמרים.

הנח את דיסק העלים במנשא הדגימה, החלק את הדבק בעזרת מברשת צבע עדינה כדי להבטיח שהדיסק מלא לחלוטין והדבק ישר עם שפת המחזיק. הנח את מנשא הדגימה במחזיק הדגימה, שאמור להיות יבש ובטמפרטורת החדר, כסה את הדגימה במשטח שטוח של מנשא דגימה מסוג B כלפי מטה. הנח את הקופסה המבודדת שהוכנה קודם לכן על גבי המכונה.

קח את הדגימה במחזיק הדגימה למקפיא בלחץ גבוה. הכנס את מחזיק הדגימה המכיל את הדגימה למקפיא בלחץ גבוה. התחל מחזור הקפאה על ידי לחיצה על כפתור הסילון האוטומטי, שאמור להסתיים תוך שנייה או שתיים במהירות האפשרית.

הסר את מחזיק הדגימה מהמכונה והנח את הקצה. החזק את הדגימה בחנקן הנוזלי בקופסה המבודדת. טבלו את קצותיהם של שני זוגות מלקחיים בחנקן הנוזלי כדי לצנן אותם לאחר ההקפאה.

יש לטפל בנשאים רק עם מלקחיים מקוררים בחנקן נוזלי הפועלים מתחת לחנקן הנוזלי. פתח את מחזיק הדגימה על ידי סיבובו נגד כיוון השעון והסר את מנשא הדגימה מהמחזיק בעזרת מלקחיים מקוררים בחנקן נוזלי, וודא שהדיסק נמצא תמיד בחנקן הנוזלי או באדים. פתח בקבוקון קריו המכיל מדיית FS והנח את המכסה בצד הקופסה.

החזק את בקבוקון הקריו עם מלקחיים מקוררים מראש והשתמש במלקחיים האחרים כדי למקם את הדיסק בבקבוקון הקריו. הברג את המכסה של בקבוקון הקריו לאחור והיזהר לא ללכוד חנקן נוזלי בבקבוקון. חנקן נוזלי מתרחב פי 700 במהלך ההתחממות וכל חנקן נוזלי כלוא יכול לגרום לפיצוצים במהלך תקופה זו.

חזור על תהליך זה עד להקפאת כל הדגימות הרצויות. ניתן להניח דיסקי עלים מרובים המכילים את אותו סוג של דגימה באותו בקבוקון. כדי להתחיל בהכנות להחלפה חופשית, טבלו לחלוטין גוש חימום אלומיניום בחנקן נוזלי למשך 10 דקות או עד שהרתיחה הגרעינית תיפסק.

בינתיים, הניחו שכבה של קרח יבש בתחתית המיכל שתשמש כתא QFS. ניתן להשתמש במיכל קלקר או דלי קרח עם קרח יבש כתוש או כדורים. יש צורך בבדיקת טמפרטורה להליך זה.

צמד תרמי ממוקם דרך החלק העליון של בקבוקון קריו כך שהוא מגיע לתחתית הצינור ומכסה הצינור אטום בשרף כך שלא ידלוף נוזל החוצה. מלאו את הצינור ב -1.5 מיליליטר אצטון בתחילת כל ריצת QFS. ודא שהמכסים על הבקבוקונים מוברגים היטב כדי שמדיית ה-FS לא תדלוף החוצה במהלך fs.

הכנס במהירות את בקבוקוני הקריו המכילים את הדגימות יחד עם בדיקת הטמפרטורה לשורות האמצעיות של בלוק החימום. התחל לתעד את הטמפרטורה באמצעות כפפות קריו מבודדות או מלקחיים גדולים. שופכים את כל החנקן הנוזלי מגוש החימום.

הקפד לא לשפוך את בקבוקוני הקריו. הנח את הבלוק המכיל את הבקבוקונים לשכבת הקרח היבש בתא QFC. ודא שהבלוק ממוקם כך שהצינורות מונחים אופקית, אך עם הטיה קלה כלפי מעלה.

לא אמורה להיות דליפה אם משתמשים בבקבוקוני הקריו הנכונים. ארזו את תא ה-QFS בקרח יבש כך שצינורות ה-FS יהיו מכוסים. למרות שאין צורך לכסות את החלק העליון של הבלוק, הנח את המכסה על החדר.

יש לבצע את ה-QFS במכסה אדים. הניחו תא QFS עם הדגימות על שייקר סיבובי פלטפורמה וסובבו במהירות של 125 סל"ד למשך 120 דקות. במהלך תקופה זו, טמפרטורת הבלוק צריכה לעלות בהדרגה לכ- 80 מעלות צלזיוס שליליות.

התסיסה מבטיחה ערבוב של הרכיבים ל-fs טוב יותר. לאחר שעתיים, הסר את הקרח היבש מהתא. השתמש בכפפת קריו כדי להרים במהירות את בלוק החימום מתא ה-QFS ולשפוך במהירות את הקרח היבש למיכל משני.

ממשיכים לרעוד עוד שעה. במהלך תקופה זו, הטמפרטורה צריכה לעלות לכ-15 מעלות צלזיוס שליליות עד 20 מעלות צלזיוס. בסוף השעה, הוציאו את הדגימות ובדיקת הטמפרטורה מתא ה-QFS והניחו אותם על השייקר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות נוספות עד שהם מגיעים לטמפרטורת החדר.

הפסק לרשום את הטמפרטורה כאשר ההחלפה החופשית המהירה מתבצעת. הסר בזהירות את מדיית ה-FS מכל בקבוקון קריו בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק והנח במיכל המתאים לפסולת רעילה. שוטפים את הדגימות ארבע פעמים עם 100% אצטון.

אוספים את שתי השטיפות הראשונות ומניחים במיכל הפסולת הרעילה. הקפד לא להשליך את הדגימות בעת הסרת האצטון. לאחר שטיפת הדגימות, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את דגימות הרקמה מנשא הדגימה.

שמור על דגימות רטובות באצטון בזמן שזה נעשה ועבוד בעדינות רבה כדי למנוע שבירת הדגימות. זה לא יוצא דופן שמשחת השמרים נופלת מהדגימות. בשלב זה, משחת השמרים היא בדרך כלל חומה כהה מאוד ואילו רקמת העלים עדיין ירוקה.

לעתים קרובות דגימות הרקמה נופלות מנשא הדגימה במהלך ה-FS אוספות את הדגימות באמצעות פיפטת העברה בבקבוקוני קריו המכילים אצטון. לאחר מכן, הדגימות מוכנות למיקרוסקופ אלקטרונים הולכה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ת. עקומה אופיינית לשינויי טמפרטורה במהלך QFS מוצגת בגרף זה.

הטמפרטורה עולה במהירות מ-196 מעלות צלזיוס, טמפרטורת החנקן הנוזלי לכ-80 מעלות צלזיוס. הזינוק בתחילת הריצה נובע מהאלקטרוניקה של הגשושית ואינו משקף את מדידת הטמפרטורה האמיתית לאחר הכנת דגימות HPF ו-QFS לצפייה במיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תוצאות אופייניות מוצגות בתמונות אלה מדגימות עלה של ארנב.

ממברנות פלזמה חלקות ונלחצות על דופן התא מעידות על קיבוע טוב. דמה פלזמה מסועפת נראית בהגדלה גבוהה. גם אברונים אחרים נראים בבירור.

הם כוללים כלורופלסטים ותילקואידים מיטוכונדריה, מיקרו-צינורות גוגי ופלזמות דסה, ה-VAEs המרכזיים הגדולים נשארים שלמים. טיפול לקוי במהלך H-P-F-Q-F-S גורם לחפצים כולל נזק שנגרם על ידי גבישי קרח וליזה. משקעי עופרת עלולים להיווצר גם במהלך צביעה של קטעים לאחר שליטה.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע וחצי שעות אם היא מבוצעת כראוי. אל תשכח שעבודה עם חנקן נוזלי וטטרוקסיד אוסמיום עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות כולל עבודה במכסה האדים ולבישת ציוד מגן אישי, כולל כפפות, מעילי מעבדה ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה.