Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Общая цель этой процедуры заключается в выделении обогащенных популяций сердечных клапанов, эндотелиальных клеток от эмбрионов и взрослых мышей с помощью эндотелиального репортера. В первую очередь это достигается путем тщательного рассечения области желудочкового канала предсердий, содержащей все створки митрального, трикуспидального, аортального и легочного клапанов сердца. Вторым этапом процедуры является диссоциация ткани клапана и высвобождение отдельных клеток путем обработки ткани серией ферментативных процедур.

Этот процесс повторяется девять раз. Затем раствор, содержащий клетки и мусор, пропускают через фильтр, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию без клеточного мусора. Заключительным этапом является сортировка и сбор диссоциированных клеток с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток.

В конечном счете, достаточно большая популяция обогащенных эндотелиальных клеток клапанов становится доступной для культивирования in vitro и молекулярного анализа. В этом подходе мы покажем, как изолировать эндотелиальные клетки сердечного клапана от мышей. Поскольку биомолекулярные инструменты хорошо зарекомендовали себя на мышиной модели.

Это позволяет использовать расширенный набор экспериментальных конструкций для исследования сердечных клапанов. Кроме того, выделение эндотелиальных клеток сердечного клапана у эмбрионов позволяет проводить ранее невозможные исследования развития. Давайте начнем.

Обязательно полностью стерилизуйте хирургические инструменты, автоклавируя их на лоток для инструментов. Место операции следует продезинфицировать, распылив на него 70% этанола. Это включает в себя микроскоп и любое другое оборудование, с которым может произойти контакт на объекте.

Следующие растворы должны быть приготовлены непосредственно перед экспериментом. Буфер диссоциации, буфер сортировки, а при культивировании культура VEC, среда и негативная культура GFP. Каждый из этих растворов необходимо простерилизовать фильтром 0,2 мкм, после чего растворы необходимо выдержать на льду до тех пор, пока они не будут использованы после углекислого газа.

Удушье мышки с последующим вывихом шейки матки. Используйте ножницы для вскрытия грудной полости. Мыши здесь гомозиготны по отношению к двум GFP или имеют отрицательный контроль, соответствующий возрасту, необходимый для сортировки фактов.

Далее обнажают сердце и легкие. Затем обхватите сердце щипцами у магистральных артерий и оттяните его от тела. Частично погрузите сердце.

В чашке с холодным HBSS в чашке подготовьте сердце к вскрытию, удалив прикрепленную легочную ткань, при этом крайне важно удалить неклапанные эндотелиальные клетки, которые могут загрязнить образец. Чтобы получить кольцо предсердного желудочкового канала, сначала удалите предсердия, аккуратно оттянув их от сердца. Далее с помощью бритвенного лезвия отрежьте желудочки, сделав надрез прямо под АВ-клапанами, области аорты должны остаться неповрежденными.

Затем сделайте разрез с одной стороны канала, чтобы открыть кольцо и обнажить структуры предсердного желудочкового клапана с помощью щипцов. Аккуратно отденьте миокард, чтобы обнажить створки клапана. Они представляют собой плотную белую ткань над миокардом.

Теперь аккуратно отсоедините cordi tendai от предсердных желудочковых клапанов, если он все еще прикреплен. И удалить проксимальные области легочной артерии и стенки аорты, которые не содержат структуры полулунного клапана. Удалите как можно больше оставшегося миокарда, не повреждая створки клапана, так как ЭКС может сместиться.

Тщательное вскрытие имеет решающее значение для удаления неклапанных эндотелиальных клеток, которые могут загрязнить образец. Поэтому постарайтесь удалить как можно больше окружающих тканей, сохранив при этом все четыре клапана нетронутыми. Наконец, поместите обрезанные клапанные области сердца в 1,5-миллилитровую трубку с одним миллилитром холодного HBSS и держите трубку на льду.

Используйте эту методику для получения изолированной клапанной ткани от взрослых животных или животных с уровнем Е 14.5 с помощью пипетки. Извлеките HBSS из трубки с салфеткой. Затем добавьте обратно миллилитр диссоциационного буфера и четыре микролитра ДНК одного.

Инкубируйте ткани в диссоциативном буфере и DN с мягкими вращениями при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи минут. Через семь минут трижды пипетируйте ткани вверх и вниз, чтобы помочь диссоциировать клетки. Отстоявшись около 15 секунд, соберите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные клетки.

Переложите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Завершите коллагеназную реакцию в 15 миллилитрах конической формы с добавлением лошадиной сыворотки. Это первая фракция сбора.

Теперь возвращаясь к трубке из осевших тканей, добавляем обратно диссоциативный буфер и ДНК один. Повторите процедуру, чтобы собрать вторую фракцию. Продолжайте повторять процесс, пока не соберется в общей сложности девять клеточных суспензий.

Теперь пропустите все фракционированные коллекции через нейлоновый фильтр 70 микрон в одну трубку для суспензии клеток без мусора. Соберите ячейки в гранулу, вращая трубку при давлении 400 GS в течение пяти минут. Затем повторно суспендируйте гранулы в миллилитр сортировочного буфера и держите их на льду до тех пор, пока их можно будет проанализировать по факсу, что и описано в тексте.

Протокольный клеточный культивирование и окрашивание также охватываются текстовым протоколом срезов тканей из двух трансгенных GFP. Мышей собирали у взрослых особей и эмбрионов Е 14,5 у взрослых. Эндотелиальные клетки клапана были идентифицированы с эндотелиальным маркером CD 31 и обнаружили, что они экспрессируют GFP.

Эти же клетки выделены из эмбрионов Е 14,5. Кроме того, коэкспрессированный CD 31 и факсимильный анализ GFP выявили GFP-положительные и отрицательные клеточные популяции из клеток, полученных из взрослых эмбрионов и эмбрионов E 14,5. Wild тип C 57 черная шестерка.

Взрослые клетки использовали для установки параметров GFP, экспрессию генов в GFP-положительных и GFP-отрицательных клеточных популяциях сравнивали методом количественной ПЦР в GFP-положительных клетках. Эндотелиальные маркеры были высокими, а миоцитарные маркеры очень низкими. В GFP отрицательных клетках.

Маркеры интерстициальных клеток клапанов были высокими. Две клеточные популяции культивировали отдельно через две недели. Положительные клетки GFP принимали морфологию и экспрессировали CD 31.

Напротив, отрицательные клетки GFP приняли мезенхимальную морфологию через девять дней. Эти клетки также экспрессировали маркер VIC альфа СМА после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии сердечных клапанов, чтобы они могли изучать механизмы развития и болезней на мышиных моделях, которые затем могут быть переведены в человеческую популяцию.