العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا التنفسية من الخلايا المستنبتة أو أنسجة الفئران ، ثم تقييم قوة إمكانات الغشاء كمقياس للحالة الخلوية. بالنسبة للخلايا المستنبتة ، يتم تحقيق ذلك عن طريق الطلاء أولا ثم معالجة الخلايا. بعد ذلك ، يتم تجانس الخلايا ويتم تمرير الجانس عبر إبرة لإطلاق الميتوكوندريا من الخلايا.

بالنسبة لأنسجة الفأر ، يتم استئصال الكبد من الفأر ثم تجانس على الجليد مع كلا النوعين من المواد الأولية. ثم يتم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لعزل الميتوكوندريا عن بقية المحتويات الخلوية. بعد أن تخضع الميتوكوندريا لبعض المعالجة ، بما في ذلك إضافة صبغة الفلورسنت الحساسة لإمكانات الغشاء ، يتم إجراء قياسات مضان TMRE لحساب قوة إمكانات الغشاء.

في النهاية ، يمكن تقييم وظيفة الميتوكوندريا والاضطرابات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام صبغة فلورية حساسة لإمكانات الغشاء بالاقتران مع قارئ لوحة الفلورسنت عند معالجتها بالميتوكوندريا الشائعة على المقرنات والمثبطات ، على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لموت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا في LS.It يمكن أيضا تطبيقها على أي نظام آخر حيث يمكن المقارنة بين عينتين مختلفتين أو أكثر من العينات المطلوبة مثل صحي مقابل مرض أو نوعين مختلفين من بمعدلات أيض مختلفة. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. نظرا لأن خطوات عزل الميتوكوندريا يصعب تعلمها.

هذا بسبب وجود الكثير من الفروق الدقيقة عند تنفيذ التقنية التي يمكن التغاضي عنها في أقسام الطريقة التقليدية. ابدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا الكلى الجنينية البشرية كما هو موضح في بروتوكول النص قبل 48 ساعة من لوحة علاج السيتوكين ، 160،000 خلية في قارورة T 1 75 لإنتاج حوالي 70٪ كثافة في وقت العلاج. ثم يجوع المصل الخلايا بعد 24 ساعة عن طريق شفط الوسائط واستبدالها بنفس الحجم من الوسائط الخالية من المصل.

أخيرا ، عالج الخلايا المتعطشة في الدم عن طريق إضافة السيتوكينات القابلة للذوبان مباشرة على وسط زراعة الخلايا لأداء عزل الميتوكوندريا. قم أولا بشفط الوسائط واغسل خلايا الالتصاق مرتين باستخدام 15 مل من محلول ملحي مخزن للفوسفات أو PBS. في كل مرة بعد الغسيل ، قم بشفط المخزن المؤقت واكشط القارورة لإزالة الخلايا الملتصقة من الأسفل.

ثم أضف 15 مل من XPBS واحد إلى كل قارورة ، وقم بالتدوير ونقلها إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 15 ملليلتر على الجليد. بمجرد الانتهاء من الكشط ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة خمس دقائق عند 700 مرة درجة مئوية أربع درجات مئوية ، باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي مع دوار دلو متأرجح بعد الطرد المركزي ، وشفط المواد الطافية والريسوس. كل بيليه في مليلتر واحد من عازلة عزل الميتوكوندريا.

بعد ذلك ، اجمع بين كل من المعلقين ونقلها إلى وعاء زجاجي صغير للتجانس في الميتوكوندريا المعلقة وعزل الميتوكوندريا إلى الوعاء الزجاجي حتى يصل المحلول إلى السطر الأول مع توصيل المدقة بالحفر ، استمر في تجانس الخلايا على الجليد بسرعة متوسطة لمدة ثلاث تمريرات. يجب توخي الحذر لإزالة فقاعات الهواء عند وضع المدقة في المحلول ، وعدم إزالة المدقة فوق السائل واستخدام سرعة ثابتة مع التمريرات المستمرة. انقل المحلول المتجانس إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم ارسم المحلول في حقنة سعة ثلاثة ملليلتر باستخدام إبرة قياس 18 ، واحدة في بوصة واحدة ونصف بوصة وطردها مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي على الجليد بإبرة قياس 27 بوصة واحدة. احرص على طرد المحلول ضد الجدار الداخلي للأنبوب للاستفادة من هذه القوة لتعطيل غشاء الخلية. كرر خطوات المحقنة ما مجموعه خمس مرات ، ثم انقل المحلول إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 600 مرة درجة مئوية أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي منضدي باستخدام دوار دلو متأرجح.

توجد الميتوكوندريا في المادة الطافية بعد هذا الدوران الأول منخفض السرعة ، بينما يتم تكوير بعض الأغشية والخلايا غير المكسورة ، وإزالة المادة الطافية بعناية وتوزيعها على ثلاثة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. ثم الطرد المركزي الأنابيب الثلاثة في دوار بزاوية ثابتة عند 10،000 مرة G أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. الميتوكوندريا من الخلايا المستنبتة تبدو بيضاء اللون.

استئصال الكبد من كل وضع باردة مثلجة ، واحدة XPBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم لشطف أي دم. انقل أنسجة الكبد إلى طبق بعيد على الثلج وقم بتقطيعها إلى قطع رفيعة باستخدام شفرة حلاقة جديدة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف الأنسجة والمخزن المؤقت المناسب إلى الوعاء حتى يصل المخزن المؤقت إلى السطر الأول.

استمر في تجانس الأنسجة على الجليد باستخدام المدقة يدويا لمدة خمس تمريرات. يجب توخي الحذر لإزالة فقاعات الهواء عند وضع المدقة في المحلول ، وعدم إزالة المدقة فوق السائل واستخدام سرعة ثابتة مع التمريرات المستمرة. استمر في معالجة العينات باستخدام الطرد المركزي والتجانس كما هو مطلوب في بروتوكول النص.

بعد الجمع بين المواد الطافية الجديدة مع أول مادة طافية من كل عينة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب في دوار بزاوية ثابتة عند 10 ، 000 مرة درجة مئوية أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بشفط الطبقة البيضاء العلوية الرقيقة بحذر باستخدام طرف ماصة أو دفعها إلى جوانب الأنبوب. ثم اسكب برفق ما تبقى من المادة المطفية والريسوس.

تعليق كريات الميتوكوندريا الكبد في 500 ميكرولتر من عزل الميتوكوندريا. الميتوكوندريا العازلة من الكبد بنية اللون. ضع العينات بسرعة على الجليد مباشرة قبل إعداد التفاعلات.

خفف الميتوكوندريا إلى 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر. تركيز العمل مع المخزن المؤقت التجريبي. أضف العلاجات المناسبة كما هو مذكور في بروتوكول النص لفصل الأنابيب في واحد 10 ، الحجم الإجمالي للميتوكوندريا المخففة.

بعد ذلك ، ضع الميتوكوندريا المخففة في كل أنبوب تفاعل وحرك كل أنبوب برفق لضمان الخلط المناسب. احتضن ردود الفعل على مقاعد البدلاء لمدة سبع دقائق. ثم أضف حجما متساويا من اثنين من رباعي إيثيل ميكرومولار ، قضيب دومين ، إستر إيثيل ، مختصر TMRE إلى حجم تفاعل الميتوكوندريا.

مرة أخرى ، قم بتحريك كل أنبوب برفق لضمان الخلط المناسب. بعد احتضان التفاعلات على سطح الطاولة لمدة سبع دقائق إضافية ، قم بتكبيل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي في دوار بزاوية ثابتة عند 10 ، 000 مرة درجة مئوية أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بتحميل نصف حجم المادة الطافية لكل عينة على 3 84.

تتابع لوحة البئر قراءة تألق العينات ثم تحسب فرق الطية في التألق بين التحكم وكل علاج كما هو موضح في بروتوكول النص لخلايا HEK 2 93 T مع عامل نخر الورم ألفا IL بيتا واحد و IFN جاما لمدة 24 إلى 48 ساعة يؤدي إلى كميات تدريجية من موت الخلايا. تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام فحوصات MTT التي توضح باستمرار أن هناك انخفاضا تقريبيا بنسبة 10٪ في صلاحية الخلية مع علاج لمدة 24 ساعة وانخفاض تقريبي بنسبة 20٪. مع 48 ساعة من العلاج الخلايا المعالجة بتركيزات مماثلة تعطي نتائج موت الخلايا مماثلة في 48 ساعة.

ويكشف العلاج بالسيتوكينات الفردية أن الانخفاض في الجدوى يرجع إلى التأثيرات التوافقية. تمثل بيانات الجدوى متوسط الانحراف المعياري لثلاث تجارب منفصلة. يوضح كل تشغيل في ثلاث نسخ وضيق أشرطة الخطأ قابلية تكرار البيانات.

النسبة المئوية للانخفاض في إمكانات الغشاء في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا المعالجة بالسيتوكين إلى أن صحة الميتوكوندريا قد تأثرت بعلاجات السيتوكين ، مما يؤكد بيانات الجدوى بعد هذا الإجراء. يمكن تشكيل طرق أخرى مثل تقييم إجمالي جيل TP أو TP أو استهلاك الأكسجين من أجل تقييم أسئلة إضافية مثل الاختلافات في الطاقة والتنفس بين العينات المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا الوظيفية السليمة وتقييم قوة إمكانات الغشاء على أنها انعكاس للحالة الخلوية.