Name: 의 라이브 영상 초파리 번데기 눈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 배우세요 Drosophila 번데기 눈 신경상피의 라이브 이미징 방법을 통해 발달 생물학에서 세포 경계 시각화와 신경발생 과정을 연구하는 기술입니다. GFP 표지 단백질을 활용한 이 프로토콜은 조직 운동 보정으로 안정적인 영상 획득이 가능합니다.

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저자는 살아있는 초파리 번데기 눈을 이미징하기 위한 독창적인 프로토콜을 개발한 David Larson에게 감사를 표합니다. 우리는 유전자 변형 파리를 개발하여 실시간 이미징 플라이 라인을 생성해 준 동료 Richard Carthew, Shoichiro Tsukita 및 Matthew Freeman에게 감사드립니다. 브리트니 볼드윈-헌터(Brittany Baldwin-Hunter)는 그 원고에 대해 도움이 되는 논평을 해 주었다. 이 작업은 웨슬리언 대학교(Wesleyan University)가 루스 존슨(Ruth Johnson)에게 수여한 창업 기금의 지원을 받았습니다.

그림 3은 실험 절차의 요약을 보여줍니다. 1. 조직 준비 <ol><li> C를 중복에 다음 십자가를 설정 관심의 유전자의 변형 된 표현의 결과를 결정하고 25 °로 유지하려면 UAS - 유전자 (수컷) X는 GMR-GAL4; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b (처녀 여성) 참고 : 제어 조직 크로스 UAS-의 lacZ를 얻으려면이 GMR-GAL4에 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP 여성. β - 갈 락토시다 아제는 망막 세포의 행동에 결함을 생성하지 않습니다. </li><li> 의 RNAi 유전자의 효능을 향상시키기 위해 크로스 UAS-의 RNAi는 GMR-GAL4, UAS-DCR-2 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b 처녀 여성. 주 : 이소성 DCR-2 발현이 관찰되었다 망막 세포 거동이 이따금 결함 (데이타 미기재). 각성이 방법을 사용하면 좋습니다. </li><li> 에스1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 당선자 흰색 해당 유전자형의 사전 번데기 및 장소. 번데기가 DCR-2를 표현하는 경우, 남성 또는 여성 중 번데기를 선택 UAS-DCR-2, X 염색체에 삽입,의 발현은 남성에 강하다. 번데기는 번데기 경우의 색소 침착 전에 0 시간 APF에서 성별화해야한다 - 남성의 생식기는 번데기 (후방에서 약 3 분의 1)의 측면에 큰 투명 글로브로 볼 수 있습니다. </li><li> 25 ° C에서 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 번데기를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 품어. 번데기 장소의 팁 상자에 증류수에 담가 조직의 10cm 2 조각, 탈수를 방지합니다. 참고 : 팁 상자에 습도가 너무 높아지면 번데기 경우 다음 단계에서 해부하는 기운이 어려운 경우가 있습니다. </li><li> 적절한 시간 동안 품어. 약 17 시간 APF, 20 시간의 APF 또는 24 시간 AP에서 이미징을위한 번데기를 준비, 눈을 패터닝과 관련된 세포의 행동을 캡처하려면F.은 특정 세포의 행동이 최선 관찰하는 경우에 대한 자세한 논의는 대표 결과를 참조하십시오. </li><li> 검은 실 가드 해부 접시에 신선한 양면 테이프의 조각을 놓습니다. 양면 테이프 (그림 1A)에 부착 된 번데기의 머리 위로 번데기, 등쪽의 위치를 .Try는 양면 테이프로 번데기의 흉부와 복부를 준수하지. 핀셋으로 조심스럽게 들어 올려 번데기 머리를 노출 아가미를 제거합니다. 한쪽 눈 주위를 노출 번데기 케이스의 측면을 따라 눈물. </li><li> 조심스럽게 접착 테이프에서 번데기를 제거합니다. 번데기가 부착 남아 있으면 접착력을 약화 번데기 케이스와 테이프 사이의 접합에 증류수의 작은 볼륨을 적용합니다. </li></ol> 2. 장착 <ol><li> 압지에서 작은 15mm 2 프레임을 구축하고 middlethat에 구멍을 펀치 직경 5.5 mm (그림 1B)입니다. 증류수와 장소에 담가현미경 슬라이드의 중심. 바셀린의 균일 한 반지를 집어 넣은, 30 CC 주사기를 사용하면 압지 프레임을 둘러싸는. 석유 젤리 링이 번데기의 폭보다 링의 직경이 커버 슬립의 폭보다 변두리에 작은 그 변두리에 더 높은 있는지 확인합니다. </li><li> 석유 젤리 비드 (그림 1D)에서 지원하는 측면에서, .Carefully 번데기를 준비 압지 (그림 1C)에 펀치 구멍에 직접 슬라이드에 석유 젤리의 작은 구슬을 추가합니다. </li><li> 석유 젤리 링의 상단에 커버 슬립을 놓고는 접촉 눈 neuroepithelium (그림 1D) 위의 상피 있도록. 부드럽게 바셀린 대해 커버 슬립을 밀봉하고 번데기 눈 영역 및 커버 슬립 사이에 작은 편평한 접촉 표면을 생성하는 제제를 압축. </li></ol> 3. 형광 이미징 <ol><li> 이미지를 사용하여 번데기 준비형광 현미경. 모든 7 분 캡처 adherens 접합의 지역에서 눈 neuroepithelium의 꼭대기의 도메인을 통해 시리얼 섹션. 참고 :) 적절한 직렬 섹션은 보통 4-5 0.2 μm의 Z-단계로 구성 Z-스택 당이다. b)는 가벼운 충돌과 주름을 포함하여 상피 세포의 토폴로지에서 부정, 조직의 큰 영역에 초점 이미지를 수집하는 것이 도전 할 수 있습니다. 촬상 동안, 하나의 초점으로 관심 영역의 부분을 찾을 수 있으며, 이웃 영역 포커스 아웃한다. 번데기 눈 및 커버 슬립 사이에 증류수 작은 액 적을 포함하면 번데기 눈 형태 형성의 초기 단계의 약간 고르지 토폴로지 특성 일부 급성 티슈하지만 주름을 제거 할 수 없다. 이러한 경우에는 합초 슬라이스는 전체 필드에 대해 획득 될 때까지 스택 Z를 확장하여 조직을 오버 샘플링. C) 매 7 분 상당한 redu없이 3 시간 4 라이브 이미징을 사용하도록 설정해야합니다 시리얼 부분을 캡처이미지 품질을 손상시킬 수 GFP 형광의 강도 ction의. 짧은 시간 구간은 영상의 총 시간을 감소시킬 수도있다. </li><li> 3 ~ 4 시간 동안 영상을 계속합니다. 번데기 성장과 체액의 펌핑 망막의 위치를​​ 이동하기 때문에 많은 형광 현미경에 사용할 수있는 자동 초점 및 시간 기능을 사용하지 마십시오 경계 다시 초점을 맞추고 매 14 ~ 21 분 필요합니다. 느리게하거나 눈의 형태 형성을 멈출 수 4시간 넘어 그 영상을 참고. </li><li> 배경을 줄이고 직렬 단면 영상의 콘트라스트를 향상시키기 위해 적절한 컨벌루션 소프트웨어를 사용한다. 각각의 Z-스택 파일의 경우, (재료의 표 참조) LAS AF 소프트웨어에서 다음을 수행 도구 패널로 이동, 3D 역대을 선택하고 적용을 클릭합니다. </li><li> 각 deconvoluted 스택 파일의 최대 투사 (MP) 이미지 생성 도구 패널로 이동, 3D 프로젝션을 선택하고 적용을 클릭합니다. 참고 : 최대 투사 알고리즘이 유니폼을 생성하는 데 실패 할 수오버 샘플링 된 조직에 대한 LY 포커스에있는 이미지입니다. - 초점 영역을 선명하게하는 기술 단계 5.2에 설명되어있다. </li></ol> 4. 번데기 구조 및 표현형 확인을 포스트 - 이미징 <ol><li> 집게가 커버 슬립을 제거하고 음식을 깨끗한 유리 병에 번데기를 전송하여 : 아티팩트가 도입 또는 이미징 동안 피해 번데기가 조심스럽게 이미징 장비에서 번데기를 제거되었는지를 해결하기 위해. 실온에서 보관 또는 25 ° C 성인 플라이가 나올 때까지. </li><li> 조심스럽게 성인 눈의 표현형을 조사하고 원래 플라이 십자가에서 신흥 성인 파리의 눈에 비교합니다. </li></ol> 5. 이미지 처리 <ol><li> 자동 이미지 정렬 : 참고 : 라이브 초파리 조직은 이동 및 촬영 과정을 통해 성장할 것입니다. 따라서, 이미지 센터는 초파리 조직에서 동일한 지점에 대응하지 않을 수도 연속 시점에서 모였다. 또한에서전체 망막 디스크는 21 ~ 23 시간의 APF 사이에 약 30 ° 회전합니다. 개별 셀 동작을 선택하고 생명체의 성장으로 인한 산만 함을 줄이고,이 수동으로 수행 할 수있는 각 MP image.While, 여기에 사용되는 이미지 편집 소프트웨어를 정렬하려면 프로세스를 신속하게 처리 할 수 있습니다 내장 된 알고리즘을하고있다 (재료의 표 참조). <ol><li> 스택에 메인 메뉴를 열고 스크립트로드를 선택 파일의 파일 탭에서. </li><li> 로드 레이어 패널에 MP 이미지 파일을 가져 오기하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다. 주 :이 옵션을 선택하면, 소프트웨어는 이미지 데이터를 왜곡 정렬 알고리즘을 이용할 수도있다. </li><li> 모든 MP 파일은 레이어 창에로드 한 후, 모든 이미지는 최초의 시점은 레이어 스택의 상단에되도록 시간 순서에 있는지 확인하십시오. 층은 올바른 순서, 드래그에없는 그들이 정렬 될 때까지 놓는 경우올바르게. </li><li> 메인 메뉴의 편집 탭에서 자동 정렬 레이어를 선택합니다. 들어 오도록을 선택하고 확인을 클릭합니다. </li><li> 자동 정렬 알고리즘은 해당 초점에 프레임 방향을 실패 할 경우, 이동 도구를 사용하여 약간의 조정을합니다. </li></ol></li><li> 복합 선명 : 참고 : 초기 MP 이미지의 포커스 아웃 영역은 &#39;자르기&#39;LAS AF 소프트웨어에 해당 deconvoluted 스택에 의해 날카롭게 할 수 있습니다. 스택 파일 자르기 한 수동 최대 투영 알고리즘을 실시 Z 스택의 간격을 제한 할 수있다. <ol><li> (프로세스 탭 아래) 도구 패널에서 자르기 기능을 찾습니다. 수동 그들이 초기 포커스 아웃 영역 내에서만 부착 벨트 스팬되도록 초기 및 최종 슬라이스를 제한. 이 지역에 최적화 된 새로운 스택 파일을 생성 적용을 클릭합니다. </li><li> TIFF 파일로 로컬에 최적화 된 스택 및 수출을위한 새로운 최대 투사를 생성합니다. </li><li> 일에전자 이미지 편집 소프트웨어 (재료의 표 참조), 스택에 (메인 메뉴의 파일 탭에 위치) 오픈 스크립트로드를 선택 파일. </li><li> 로드 레이어 패널에 특정 시점의 초기 MP 이미지 파일을 로컬에 최적화 된 MP 파일을 가져하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 창 레이어의 두 레이어를 선택하고 균일 망막 분야에 초점을 맞 춥니 산출, 자동으로 두 이미지의 해당 영역을 마스크 (메인 메뉴의 편집 탭에 위치) 자동 혼합 레이어를 선택합니다. TIFF 파일로이 합성 이미지를 저장합니다. </li><li> 반복하여 모든 차선 MP 이미지에 대한 5.2.5을 통해 5.2.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 또한 조정 : 회전, 자르기 및 조정 동영상 레이어의 레벨 : <ol><li> 모든 레이어를 선택한 상태 망막의 지느러미 - 복부 축이 정렬되도록 이미지를 회전 변환 도구 (편집&gt; 자유 변형)을 사용하여동영상 프레임의 Y 축에 관한 것이다. </li><li> 필요한 경우, 원하는 크기와 형상으로 시야를 감소시키기 자르기 도구를 사용한다. </li><li> 세포막과 전지 본체 사이에 콘트라스트를 향상시킬 수 있도록 (각 프레임의) 레벨 조정을 사용한다. </li><li> 문체의 목적을 위해 각 프레임에 대한 관심의 포인트를 강조하기 위해 거짓 컬러를 도입, 특정 세포의 행동을 강조하는. </li></ol></li><li> 애니메이션 : 동영상으로 이미지를 변환 : <ol><li> 메인 메뉴의 윈도우 탭에서 애니메이션 창을 엽니 다. 애니메이션 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 메뉴에서 레이어에서 프레임 만들기를 선택합니다. </li><li> 층 스택의 바닥부터 시작하여 순차적으로 애니메이션 창에 추가되어 있습니다. 먼저 모든 프레임을 선택하고 애니메이션 창 메뉴에서 역방향 프레임을 선택, 프레임의 순서를 반대로합니다. </li><li> 엄지 아래 프레임 드롭 다운 메뉴를 사용하여 각 프레임에 대한 프레임 지연 시간을 선택손톱. 참고 : (1) 본 논문에서는 4 영화의 프레임 지연은 0.8 초이다. </li><li> 주 메뉴를 열고 수출의 파일 탭에서 비디오 렌더링을 선택합니다. 파일 옵션에서 QuickTime 내보내기를 선택하고 원하는 비디오 형식을 선택합니다. 옵션 정의에 프레임 속도를 설정 렌더링에서, 15의 프레임 속도를 입력하고 렌더링을 클릭합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

야생형 개발 위의 설명은 RNAi의 패터닝에서 이벤트 또는 과발현 유전자형의 비교를위한 기초를 형성한다. 세포의 행동이 관심의 단백질에 의해 조절되는 정확하게 결정할 때 라이브 조직 개발의 비교는 매우 중요하다. 또한, 설명을 생략하고, 생균 촬상 한 그 패턴 눈 이벤트에 관심 유전자의 역할을 정 성적 및 / 또는 정량적으로 설명을 할 수있다. 30 ~ 32 시간의 APF으로 대부분의 색소 세포가 안정 위치를 획득 한 세포 사멸은 망막 분야에서 초과 세포를 정리했다. 1 ° S 미묘 확장됨에 따라 이웃이 직사각형 ° 셀의 폭이 작아, 12 °가 육각형 일이고 :이 후, 만 미묘한 변화는 색소 세포가 특징 형상을 채택로서 관찰된다. 안료 및 렌즈 재료의 후속 세대 가능성 adherens 접합부 성공적인 촬상을 방해한다. 발 비록라이브 번데기 눈 이미징 때 uable 전략은 몇 가지 함정을 염두에 두어야합니다. 첫째, 전방 번데기 케이스를 제거하면 장착 및 이미징 동안 탈수, 발...

화합물 초파리의 눈은 액세서리 색소 세포 4,5의 벌집 격자로 구분하여 그 ~ 750 ommatidia, 개안의 틀에 박힌 배열을 특징으로한다. 로컬 셀 움직임 세포 성장, 세포 형상의 변화, 세포 사멸 이러한 색소 세포는 이벤트 코디 조합에 의해 패터닝된다. 이 상피 세포의 실시간 시각화 하나는 생리 학적으로 적절하고 교란 입체 맥락에서 이러한 이벤트를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이전의 프로토콜 -6,7- 대조적으로, 여기에 설명 된 기술들은 화상 형성 공정에서 커플 해제 할 수없는 불필요한 조직의 움직임을 안정화시키기위한 효율적인 방법을 포함한다. 영상의 과정을 통해, 성장 회전하는 조직과 변화 -이 방법은 개발 초파리 번데기 눈 상피 세포 행동의 연구를 강화한다. 또한 모션 안정화 기술에서는 드여기에 스 크라이 빙 외부 이동되기 다른 상황에서 세포를 연구하는 데 유용 할 것입니다. 눈 특정 드라이버 GMR-GAL4 1-3의 통제하에 GFP : GFP뿐만 아니라 UAS-α-catenin의를 : 초파리 망막 분야에서 셀 경계를 시각화하기 위해 유전자 변형 플라이 라인은 UBI-DE-cadherin의 발현가 생성되었다. 두 GFP 태그가 막 마커의 사용은 낮은 강도의 빛 셀 경계의 시각화 수 있습니다. 이는 고 에너지의 파장에 반복 노출 활성화, 증가 된 프레임 레이트 및 동영상 구간에 조직 손상을 최소화하고 광표백. UAS-DCR-2는 제 2 플라이 라인 (8)에 통합되었다의 RNAi 유전자의 효능을 강화합니다. 이전의 프로토콜의 세 번째 업데이트에서는 실험실에서 가장 용이하게 조립된다 촬상 간단한 장비를 설명한다. 이 장치는 특수 촬상 R을 갖도록 요구를 미연에 방지IG는 대학의 &#39;기계 공장&#39;또는 이와 유사한 서비스에 의해 생성. 이 영상 장비는 이미지를 다른 번데기 조직 9, 10에 사용되는 것과 유사하다. 직접 17-42 시간 puparium 형성 HR (APF) ~ 후 안구로부터 패터닝에 기여 형태 발생 이벤트를 평가하기 위해 사용될 수있는 단순한 라이브 셀 이미징 프로토콜이 여기에 제시했다. 즉,이 프로토콜은 번데기 개발 중에 유전자 발현을 변경하는 결과를 결정하기 위해 하나를 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>GMR-갈4; UAS-a-고양이 : GFP, 유비 - 드 - Cadherin : GFP; + / SM5-TM6b</td> 작성자<td></td><td></td><td>의 요청에 따라 사용 가능</td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat : GFP, 유비 - 드 - Cadherin : GFP; + / SM5-TM6b&nbsp;</td>저자<td></td><td></td><td>의 요청에 따라 사용 가능</td></tr><tr><td>스카치 더블 스틱 테이프</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>블랙 실가드 해부 접시</td><td></td><td></td><td>유리 페트리 접시를 실가드 (곱게 빻은 숯 가루로 검은 색) 또는 실가드 170으로 테두리까지 채우십시오. 실가드 다우 코닝을 중합시키기 위해 24-48 시간 동안 실온에서 방치하십시오</td></tr><tr><td></td><td></td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>실가드 (블랙)</td> <td>다우 코닝</td><td></td><td></td>SYLG170</tr><tr><td>유리 페트리 디쉬</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm 유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm 유리 커버슬립</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm 크로마토그래피 종이</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>또는 현지 약국에서 구입하십시오.</td></tr><tr><td>30ml 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF 버전 2.6.0.7266 현미경 소프트웨어</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

초파리 번데기 개발의 고유 프로세스는 이동 및 라이브 세포 이미징 동안 추적 개별 셀 동작을 어렵게 방법으로 눈의 상피 세포를 왜곡 할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 다음과 같습니다 망막 회전, 세포의 성장과 생명체의 움직임을. 번데기가이 도전 하나의 초점면에서 몇 ommatidia, 개안 이상의 포커스에있는 이미지를 수집 할 수 있도록, 이미징을위한 준비로서 또한, 미묘한 범프 등 상피의 토폴로지, 불규칙 자주 소개 주름입니다. 워크 플로는 초파리 번데기 눈 개발하는 동안 세포 과정의 쉬운 분석을 가능하게 구제 여기 이러한 문제를 설명했다. 적절하게 준비된 번데기 용이 대부분 실험실에서 조립 될 수 촬상 장비에 배치되어 유비퀴틴 DE 카데 :. GFP와 GMR-GAL4 구동 형 UAS-α 카테닌 : GFP를 눈 상피 1 셀 경계를 시각화하는데 사용 -3입니다. 디컨 볼 루션은 후다중 초점면에서 촬영 된 형광 화상에 적용된 최대 투사 화상은 각 시점에 대해 생성 및 편집 소프트웨어를 사용하여 강화된다. 정렬 알고리즘은 추적 할 개별 셀의 동작은 더 쉽게, 빠르게 불필요한 움직임을 안정화하는 데 사용됩니다.

번데기 눈의 라이브 영상은 neuroepithelium의 패턴에 기여하는 세포의 행동을 관찰하는 성공적인 전략이다. 특정 단백질의 역할은 쉽게 눈 개발하는 동안 단백질 수준을 수정하여 유전자 발현을 평가할 수있다. 이 GMR-GAL4을 할 수있는 형태 형성 고랑 뒤에 유전자 발현을 구동하는 데 사용된다. 이것은 처음 두 령 유충 동안 눈 필드를 확립 이전 이벤트를 교란하지 않는 이점을 제공한다. 또한 다수의 RNAi 유전자를 효과적으로 (데이터 미도시) 단백질 수준을 줄이기 위해 상당한 시간을 필요로한다. GMR-GAL4 드라이버 라인은 종종 상처 진행 변태 동안 눈 디스크의 세 번째 애벌레 령 눈 개발 및 외반 수 있습니다 크게 번데기 눈의 형태 형성 동안 만 나중에 단백질 수준을 감소에 따라서의 RNAi 유전자를 운전. 유생은 그러나 고효율의 RNAi 유전자에 의해 교란되면, 십자가 할 수있는 비행0 열연 APF에서 25 ° C로 전송 유전자 발현 및 번데기를 줄이기 위해 18 ° C로 유지...

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 동공 눈 발달에 대한 라이브 이미징 동영상을 생성하는 효율적인 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 동공의 O perm을 제거하고 한쪽 눈의 신경 상피를 노출시키기 위해 측면을 따라 찢음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이미징 장비를 조립하고 번데기를 작은 바셀린 구슬에 장착하는 것입니다.다음으로, 접착 벨트 영역에 있는 신경 상피의 연속 절편은 표준 형광 현미경을 사용하여 획득합니다. 마지막 단계는 표준 이미지 편집 소프트웨어에서 푸티지를 안정화하고 색상을 조정하는 것입니다. 궁극적으로, 초파리 신경 상피의 살아있는 세포 이미징은 패턴이 형성된 세포 행동을 밝히는 데 사용됩니다.번데기는 이 단계에서 다소 연약하기 때문에 번데기를 부분적으로 해부한 다음 이미징 리그에 올바르게 장착하는 것이 까다로울 수 있으므로 이 방법의 눈 시각적 시연이 중요합니다. 또한 번데기의 올바른 방향과 눈 상피 위의 커버 슬립을 올바르게 배치하는 것은 성공적인 이미징을 위해 매우 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Mark Hellerman이 맡을 것입니다.실험을 시작하려면 이전에 교차된 유전자형에서 흰색 pre puy를 선택하여 1.5ml 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 증류수에 적신 10cm 제곱 티슈 조각을 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 넣습니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 팁 상자에 삽입합니다.젖은 조직은 번데기의 건조를 방지하고 섭씨 25도에서 17-25시간 동안 배양합니다. 배양 후, 검은색 시가 해부 접시에 새로운 양면 테이프 조각을 놓습니다. 번데기의 등쪽을 위로 향하게 하여 테이프에 놓고 번데기의 흉부와 복부 부위를 접착하지 않고 번데기의 머리가 양면 테이프에 부착되어 있는지 확인합니다.집게를 사용하여 A 펌을 조심스럽게 들어 올려 제거하여 동공 머리를 드러냅니다. 다음으로, 동공 케이스의 측면을 따라 찢습니다. 한쪽 눈 주변을 노출시키려면 접착 테이프에서 동공을 부드럽게 제거합니다.압지로 15제곱밀리미터 크기의 작은 프레임을 만들고 가운데에 5mm 구멍을 뚫습니다. 프레임과 증류수를 담그고 현미경 중앙에 놓습니다. 30cc 주사기로 밉니다.균일한 바셀린 링을 짜서 압지 프레임을 둘러쌉니다. 다음으로, 슬라이드에 작은 바셀린 구슬을 직접 추가합니다. 번데기를 조심스럽게 옆으로 눕히고 바셀린 비드로 지지합니다.바셀리 링 위에 커버 슬립을 놓아 눈 위의 상피와 접촉하도록

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

이 비디오에서는, 우리는 불균형 그대로의 감각 기관의 전구 세포와 표피 세포를 나누지 라이브 셀 이미징에 대한 방법을...

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 초파리 생활에 모자이크 광 수용체 세포를 시각화하는 것을 포함한다. 그것은 일 또는 몇 주 동안 망막에있는 각각의 광 수용체 세포의 운명을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 망막 변성 및 신경 퇴행성 질환 또는 광 수용체 세포 개발 연구에 이상적입니다.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

여기에서는 번데기를 완전히 제거하는 번데기 단계에서 초파리 다리의 장기 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

배우세요 Drosophila 번데기 눈 신경상피의 라이브 이미징 방법을 통해 발달 생물학에서 세포 경계 시각화와 신경발생 과정을 연구하는 기술입니다. GFP 표지 단백질을 활용한 이 프로토콜은 조직 운동 보정으로 안정적인 영상 획득이 가능합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

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