جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ في المختبر

الهدف العام لهذا البروتوكول هو إنتاج مجاميع موحدة من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر التي تخضع للتنظيم الذاتي والاستطالة المحورية وثقافة التعليق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي ، مثل دور تفاعلات الأنسجة في مواصفات الوصول والتنظيم الذاتي في عمليات مثل علاقة الغاز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة الأحداث التنموية من منظور تفكيكي جديد خارج الجنين قبل التجميع.

الحفاظ على الخلايا الجنينية للفأر أو M MECs في ES. ارفع الوسط على قوارير معالجة بزراعة الأنسجة المطلية بالجيلاتين بمساحة 25 سم مربع لتوليد الركام. ابدأ بقارورة زراعة الأنسجة التي تحتوي على خلايا بنسبة 40 إلى 60٪ التقاء ، واستنشق الوسط واشطف القارورة مرتين. باستخدام PBS ، أضف ملليلترا واحدا من نقطة 25٪ تريبسين EDTA واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا لفصل الخلايا عن القارورة.

بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسط Es.Lift إلى تعليق الخلية المنفصل واخلطه جيدا. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وأخرج كمية ملليلتر واحدة لحساب الخلايا. أضف خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة إلى خمسة ملليلتر من PBS الدافئ وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 170 مرة G لمدة خمس دقائق.

استنشق المحلول دون إزعاج الحبيبات. ثم أضف خمسة ملليلتر من PBS برفق وكرر الطرد المركزي. استنشق الحد الأقصى للحجم دون إزعاج حبيبات الخلية.

لمنع ترحيل PBS. أعد تعليق بيليه الخلية في مليلتر واحد من الدافئ N اثنين B 27 متوسط. الخلط جيدا مع ماصة P 1000 لتوليد معلق خلوي متجانس.

ثم قم بتخفيفه بأربعة ملليلتر إضافي من N اثنين B 27 متوسط. انقل معلق الخلية إلى خزان معقم باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج الخلايا جيدا وانقل 40 ميكرولترا من معلق الخلية من الخزان إلى كل بئر في ثقافة غير نسيجية معالجة.

96 لوحة بئر. تستخدم لوحة زراعة غير الأنسجة على وجه التحديد لتقليل التصاق الخلايا باللوحة. احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة للسماح بتراكم الخلايا بعد 48 ساعة.

قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وراقب الخلايا تحت مجهر مقلوب وتأكد من وجود الركام. أضف حجما 10 مللي مولار CHI 9 9 0 2 1 محلول مخزون لتسخين N اثنين B 27 لعمل تركيز نهائي لثلاثة ميكرومولار. هذا وسيط ثانوي لتحفيز الخلايا.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 150 ميكرولترا من الوسط الثانوي لكل بئر. بقوة كافية لإخراج أي مجاميع ملتصقة. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة بعد الحضانة.

قم بإزالة الوسيط بعناية دون شفط تراكم الخلية. أضف 150 ميكرولتر من جديد N اثنين B 27 إلى كل بئر بقوة كافية لإخراج أي مجاميع ملتصقة. كرر هذا كل 24 ساعة لمدة حضانة إجمالية لمدة خمسة أيام تقريبا.

لتحضير الركام للتثبيت، قم أولا بشفط محلول الحضانة برفق من كل بئر يحمل الماصة بزاوية 30 درجة. لمنع شفط تراكم الخلية ، أضف 150 ميكرولترا من PBS لكل منها. حسنا ، انتظر بضع دقائق حتى يستقر الركام في الأسفل ثم استنشق PBS.

كرر خطوة الغسيل هذه مرتين أخريين باستخدام مقص معقم. قم بقص طرف ماصة P 1000 عند حوالي ثلاثة ملليمترات فوق توزيعها. انتهي بهذا الطرف ، قم برفع الماصة وإطلاق كمية صغيرة من السائل في البئر.

لتحريك الركام وفكه من قاع البئر. ثم ارسم الركام في الطرف وانقل الركام إلى تشريح ذبابة الفاكهة الزجاجي. حسنا باستخدام نفس الإجراء ، اجمع كل الركام الذي ستخضع لإجراءات تلطيخ مناعي متطابقة في تشريح واحد.

ضع التشريح جيدا تحت المجهر وقم بتدويره لتحريك الركام نحو المركز. ثم استنشق PPS بعناية من حافة البئر. الحرص على عدم إزالة أي مجاميع.

لإصلاح الركام ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الفورمالديهايد الطازج 4٪ واحتضان الأطباق في شاكر مداري لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. ضبط على سرعة منخفضة. شفط محلول الفورمالديهايد بعناية لمنع شفط أي مجاميع ، ثم أضف ملليلتر واحد من PBS إلى البئر.

أعد اللوحة إلى شاكر المداري لمدة 10 دقائق. قم بإزالة PBS من البئر وكرر خطوة الغسيل هذه مرتين أخريين. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول P-B-S-F-T وضع اللوحة على شاكر المداري لمدة 10 دقائق.

استنشق المحلول وكرر الغسيل مرتين أخريين. أضف ملليلتر واحد من P-B-S-F-T لكل بئر لمنع الركام من النشاط المناعي غير المحدد. ضع اللوحة على شاكر المداري بسرعة منخفضة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

بعد الحضانة ، قم بشفط محلول الحجب بعناية من الآبار وأضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المخفف في P-B-S-F-T. أغلق اللوحة بالشكل لمنع التبخر واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على شاكر مداري بسرعة منخفضة. بعد ذلك ، استبدل محلول الأجسام المضادة الأولية ب P-B-S-F-T المبرد مسبقا.

اغسل الركام عن طريق وضع اللوحة على شاكر المدار. اضبط على سرعة منخفضة عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. كرر الغسيل مرة أخرى.

قم بإجراء دورتي غسيل إضافيتين باستخدام P-B-S-F-T عند أربع درجات مئوية بسرعة منخفضة على الخلاط المداري. كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإزالة محلول الغسيل واحتضانه ب 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في P-B-S-F-T. أضف ميكروغراما واحدا لكل مليلتر من هيرست لتصور النوى تحتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على دوار دوراني محمي من الضوء.

قم بإجراء دورة غسيل أخرى باستخدام PBS FT عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء تحت صندوق ملفوف بورق الألمنيوم. قم بإجراء غسلات إضافية باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.2٪ FBS و 0.2٪ Triton X 100 أو PBT المؤقت في درجة حرارة الغرفة. بعد شفط المحلول بعناية ، احتضن الركام بملليلتر واحد من الجلسرين واحد إلى واحد إلى PBT لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

ثم احتضنهم بملليلتر واحد من سبعة إلى ثلاثة جلسرين إلى PBT لمدة 30 دقيقة. لتحضير العينات للتصوير متحد البؤر عند شفط الجلسرين إلى محلول PBT واستبدله بملليلتر واحد من وسط التركيب. ثم قم بتركيب الركام في قطرات سعة 17 ميكرولتر على شريحة زجاجية.

باستخدام طرف ماصة ، قم بإعداد فاصل عن طريق طي قطعة من الشريط على الوجهين أربع مرات على نفسها. ثم ضع فاصلا واحدا على جانبي الركام على الشريحة ، واقلب الغطاء ، وانزلق على الفواصل ، ثم قم بتصوير الركام باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. بعد 48 ساعة من الطلاء ، يتم تشكيل الركام الذي يبلغ قطره حوالي 150 ميكرومتر ، وعرض حدود ناعمة.

من ناحية أخرى ، قد يؤدي الطلاء غير الأمثل لعدد الخلايا أو التصاق الخلية بالجودة المتوسطة أو التصويب غير الأمثل إلى الفشل في التجميع بشكل صحيح. 120 ساعة من العلاج المستمر باستخدام CHI 9 9 0 2 1 يتسبب مثبط سينسيز كيناز الجليكوجين الثالث في استطالة الركام الكروي. أيضا ، هناك توطين مميز للخلايا الإيجابية SOX GFP في أحد طرفي الركام بعد المعالجة ، وتؤدي العلاجات المختلفة إلى تغييرات مختلفة في مورفولوجيا الركام الفردي وفي علامة الفلورسنت.

يمكن تتبع الترجمة ضمن التجميع بمرور الوقت. بمجرد إتقانها ، سيتمكن الباحث من إنشاء مجاميع في غضون 45 دقيقة تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بمجرد تكوين الركام ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Q-R-T-P-C-R بدلا من التلوين المناعي للتحقيق في التغيرات في التعبير الجيني داخل المجاميع.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين مجاميع من MECs ، وتطبيق محفزات محددة وإعداد المجاميع للتلوين المناعي وتحليل المجهر متحد البؤر.