ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать миоволокна от flexo digitorum brevis мышей, чтобы сарколемма могла быть впоследствии повреждена с помощью лазерного ранения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что функция белка и его локализация могут быть изучены в зрелых миоволокнах без необходимости создания трансгенных мышей. Этот метод может быть адаптирован для тестирования фармацевтических агентов и других методов повреждения клеток.

Начните с размораживания раствора коллагеназы. Далее подготовьте две лунки из 12-луночной пластины. Чтобы каждое волокно было изолировано в одном, хорошо добавьте миллилитр предогрева, ДМЕМ плюс БСА загрузите в другое лунку миллилитр предогревающего одного х звонков.

Также приготовьте 35-миллиметровую форму для сигар с 10 миллилитрами свежего одного х звонков. После снятия ног с трансфицированного животного приколите одну ногу тугой подошвой вверх к сигарной чаше иглами 30 калибра через каждый из пяти кончиков пальцев. А на щиколотке подготовьте каждую ногу следующим образом.

Сначала обрежьте кожицу. Начните с щиколотки и разрежьте вдоль линии роста волос до пальцев ног. Будьте осторожны, чтобы не задеть мышцы под кожей.

Далее обхватите кожу у основания лодыжки и разрежьте поперек пятки. Затем поднимите кожный лоскут с помощью щипцов и направьте ножницы на кожу, а не на мышцу, и осторожно отрежьте соединительную ткань, чтобы удалить кожу. Теперь, чтобы удалить мышцу FDB, начните с разрезания большого сухожилия в области пятки, чтобы освободить его от кости.

Затем отделите пучок FDB от большого белого сухожилия. При этом аккуратно удалите прикрепленную соединительную ткань. После завершения поднимите пучок с нижележащих сухожилий, чтобы открыть ярко-белые сухожилия, ведущие к пальцам.

Пучок должен легко подниматься вверх. Затем освободите пучок от стопы, разрезав белое сухожилие возле пальцев ног. Перенесите мышечный пучок в лунку DMEM плюс BSA и повторите процесс на другой ноге, прежде чем продолжить.

Теперь есть возможность проверить успешность проведения электропорации, которая отражена в текстовом протоколе. Выполните эту диагностическую проверку на инвертированном флуоресцентном микроскопе. В случае успеха эффективность трансфекции может составить до 90%После того, как все пучки FDB были выделены, добавьте в каждый по 100 микролитров раствора коллагеназы.

Хорошо инкубируйте планшет во влажном 37 градусах Цельсия инкубаторе с атмосферой 10% углекислого газа в течение примерно часа. Это будет варьироваться в зависимости от модели заболевания, а также зависит от эффективности ферментов. Как только инкубация будет завершена, осторожно переложите пучки FDB в раствор для кольцевателя.

Затем лунки тритруют пучки с помощью одномиллилитровой пипетки с расширенным отверстием, делают это осторожно около 15 раз в течение итерации, наблюдают, чтобы неповрежденные волокна отваливались в раствор. Если этого не происходит, то инкубацию в коллагеназе необходимо продлить. Должное внимание к пищеварению.

Время и сила титрования имеют решающее значение в этой процедуре. Переваривание, фрагментация клетчатки и повреждение sarco leal могут привести к неоптимальной подготовке мышц. Теперь соберите выделенные волокна в раствор и перенесите до половины миллилитра раствора в культуральную тарелку.

Продолжайте давать мышцам перевариваться еще 15 минут. Затем повторите обработку и при необходимости снова соберите изолированные волокна. Подождите еще 15 минут и повторите процесс в третий раз.

После того, как волокна будут прикреплены к блюду не менее 15 минут, разведите остаточную коллагеназу свежими кольцами или вовсе смените раствор. Теперь волокна готовы к визуализации плазмиды. ДНК, кодирующая флуоресцентно меченный белок, трансфицировали в мышечный пучок FDB.

Для этой цели хорошо подходит промотор ЦМВ. Флуоресценция может наблюдаться в нескольких изолированных миоволокнах через семь дней после электропорации. Затем мышца FDB переваривалась, и в этом процессе выделялись миоволокна.

Повреждение миоволокон может произойти, как указано белой стрелкой. Черные стрелки показывают пятна в мембране сарколеммы. Такие волокна были удалены из эксперимента.

Неповрежденные миоволокна визуализировали с помощью DIC fm. Краситель номер 4 64 присутствовал при минимальной флуоресценции FM 4 64 на мембране миофибры до повреждения. Просмотр миоволокон с FM-нагрузкой с помощью конфокальной микроскопии позволил получить более подробную информацию.

Центрированная миофибра лишена ядер. Такие ядра могут влиять на анализ FM-красителя, и их следует избегать, чтобы вызвать повреждение мембраны. Поместите перекрестие ROI на положительную саркому FM D, начните протокол мембранной абляции Как только освоите.

Эта техника может быть выполнена примерно за два часа. И при попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что время пищеварения зависит от активности коллагеназы, генетического фона и модели заболевания.