Intégration de Wet and Processes Banc sec Optimise ciblés Séquençage de nouvelle génération de faible qualité et à faible quantité biopsies de tumeurs

L’objectif global de cette procédure est de décrire un système complet de séquençage d’échantillons de cancer difficiles qui combine des réactifs de laboratoire humide, des contrôles standardisés et une suite bioinformatique de pointe. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la façon de séquencer des biopsies tumorales en faible quantité et de faible qualité pour obtenir des analyses et des interprétations précises des variantes de l’ADN. Le principal avantage de cette méthode est que les échantillons difficiles à séquencer sont ceux qui ont simplement des quantités d’ADN limitées disponibles qui peuvent être analysés rapidement et de manière fiable à l’aide de réactifs et de contrôles à source unique et d’un logiciel bioinformatique entièrement intégré.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la complexité du NGS ciblé, que cette méthode simplifie. Cependant, les procédures de quantification des banques et de regroupement d’échantillons nécessitent une attention particulière pour obtenir une couverture uniforme dans toutes les banques d’échantillons. Ce protocole intègre des processus de banc humide et sec pour le séquençage d’échantillons de cancer difficiles.

La première étape est la quantification et la qualification de l’ADN pour déterminer le nombre de copies de matrice d’ADN qui peuvent être amplifiées par PCR en temps réel. Commencez la procédure de quantification de l’échantillon et de contrôle de la qualité en préparant une quantité suffisante d’un mélange maître dans un tube de microcentrifugation. Utilisez les volumes suivants par échantillon, 5 microlitres de 2x master mix, 0,5 microlitre de mélange de sonde d’amorce, 0,5 microlitre de mélange de sonde d’amorce d’inhibition, 0,05 microlitre de ROX et 2,95 microlitres de diluant.

Ajoutez neuf microlitres du mélange principal dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez un microlitre d’étalons d’ADN en double et mélangez en pipetant cinq fois de haut en bas. Après s’être assuré que l’échantillon d’acide nucléique est bien mélangé, ajoutez un microlitre de l’échantillon au mélange principal et mélangez en pipetant de haut en bas cinq fois.

Placez la plaque scellée dans le système PCR. Effectuez des cycles de PCR de 10 minutes à 95 degrés Celsius suivis de 40 cycles de 15 secondes à 95 degrés Celsius et d’une minute à 60 degrés Celsius. Analysez les données de qPCR en générant un graphique de régression linéaire pour chacun des étalons d’ADN dupliqués.

La concentration de l’ADN inconnu en nombre de copies fonctionnelles ou amplifiables par microlitre est ensuite calculée comme décrit dans le texte du protocole. L’étape suivante, après la quantification de l’échantillon et le contrôle de la qualité, est l’enrichissement des séquences de points chauds du cancer par PCR multiplexe à tube unique. Gene specific ou gsPCR, sera réalisée pour enrichir 46 loci dans 21 gènes cancéreux.

Préparez une quantité suffisante de master mix gsPCR dans un tube de microcentrifugation en utilisant les volumes suivants par échantillon, cinq microlitres de master mix d’amplification 2x et un microlitre de panel d’amorces pan-cancer. Aliquote six microlitres du master gsPCR se mélangent dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez quatre microlitres de chaque échantillon d’acide nucléique dans des puits individuels.

Mélangez en pipetant cinq fois de haut en bas. Incluez les contrôles appropriés. Placez la plaque scellée dans le thermocycleur pour les cycles PCR suivants.

Cinq minutes à 95 degrés Celsius. 15 secondes à 95 degrés Celsius suivies de quatre minutes à 60 degrés Celsius pour deux cycles. 15 secondes à 95 degrés Celsius suivies de quatre minutes à 72 degrés Celsius pour 23 cycles.

Une dernière prolongation de 10 minutes à 72 degrés Celsius, suivie d’une attente à quatre degrés Celsius. Après la PCR spécifique au gène, effectuez 10 cycles de PCR par balise pour incorporer des adaptateurs spécifiques à la plate-forme pour la compatibilité avec le séquençage de nouvelle génération. Ajoutez 7,5 microlitres du mélange principal d’indice 2x et 5,5 microlitres d’un code d’indice à un puits spécifié dans une plaque à 96 puits et mélangez en pipetant cinq fois de haut en bas.

Ouvrez soigneusement la plaque gsPCR et ajoutez deux microlitres de produit gsPCR à la nouvelle plaque avec le mélange maître. Placez la plaque scellée dans le thermocycleur pour les cycles PCR suivants, cinq minutes à 95 degrés Celsius, 30 secondes à 95 degrés Celsius, 30 secondes à 55 degrés Celsius et une minute à 72 degrés Celsius pour 10 cycles, et une prolongation finale de 10 minutes à 72 degrés Celsius. Suivi d’un maintien à quatre degrés Celsius.

Après la PCR, la purification de la banque et la sélection de la taille sont réalisées à l’aide de la chimie des billes magnétiques. Commencez cette procédure en ajoutant 11 microlitres de billes magnétiques de préparation pure de bibliothèque dans des puits séparés d’une plaque à 96 puits. Ouvrez la plaque tag-PCR et ajoutez 10 microlitres de produit tag-PCR dans les billes et mélangez en pipetant cinq fois vers le haut et vers le bas.

Incuber le mélange pendant quatre minutes à température ambiante. Placez la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant quatre minutes. Avec la plaque à 96 puits toujours sur le support, retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.

Après avoir lavé les billes deux fois avec un tampon de lavage contenant de l’éthanol comme décrit dans le texte du protocole, séchez les billes pendant deux minutes à température ambiante, puis retirez la plaque du support. Remettez les billes en suspension en ajoutant 20 microlitres de tampon d’élution dans chaque puits et en pipetant de haut en bas cinq fois. Incuber pendant deux minutes à température ambiante.

Replacez la plaque à 96 puits sur le support magnétique pendant quatre minutes et retirez et transférez soigneusement 18 microlitres de surnageant transparent dans un puits dans une nouvelle plaque à 96 puits. L’étape suivante de ce protocole est la quantification de chaque banque d’échantillons purifiés par PCR en temps réel relativement compétitive. Pour commencer cette procédure, préparez une quantité suffisante de mélange maître LQ dans un tube de microcentrifugation en utilisant les volumes suivants par échantillon, cinq microlitres de mélange maître 2x LQ, deux microlitres de mélange de sonde d’amorçage LQ, 0,5 microlitre de LQ standard et 0,5 microlitre de LQ ROX.

Ajoutez 8 microlitres du master mix LQ dans un puits d’une plaque optique à 96 puits. Dans des puits séparés, ajoutez deux microlitres d’une dilution en série de la bibliothèque, deux microlitres de contrôle positif LQ et deux microlitres de diluant LQ et mélangez en pipetant cinq fois vers le haut et vers le bas. Placez la plaque scellée dans le système de PCR et attribuez des détecteurs FAM et VIC à chaque échantillon.

Effectuez une amplification PCR en utilisant les conditions de cycle suivantes, cinq minutes à 95 degrés Celsius et 15 secondes à 95 degrés Celsius, suivies d’une minute à 60 degrés Celsius pendant 40 cycles. La concentration de chaque échantillon est ensuite calculée comme décrit dans le texte du protocole. Après la quantification de la banque, chaque banque d’échantillons est normalisée en fonction de sa concentration mesurée et regroupée dans un seul tube pour le séquençage.

Un module d’analyse simplifié est utilisé pour faciliter les calculs pour la normalisation des bibliothèques et la mise en commun des échantillons. Pour normaliser la banque, il faut d’abord déterminer la concentration médiane en nanomolaires dans tous les échantillons, chacun contenant un indice unique par paire à regrouper. Ensuite, déterminez le volume d’échantillon individuel en microlitres à regrouper en multipliant la concentration médiane de tous les échantillons par cinq, puis en divisant par sa concentration individuelle.

Ajoutez le volume normalisé de chaque échantillon dans un seul tube de microcentrifugation pour créer le pool d’échantillons. Diluer le pool d’échantillons à 1,25 nanomolaire à l’aide d’un diluant de séquençage. Préparer le pool d’échantillons pour le séquençage en le dénaturant en présence de phix control V3. Combinez les éléments suivants, 15 microlitres de pool d’échantillon de 1,25 nanomolaire, trois micorlitres de phix nanomolaire et deux microlitres d’hydroxyde de sodium 1N.

Après un bref tourbillon et une centrifugation, incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez 8 microlitres de la bibliothèque dénaturée à 992 microlitres de tampon HT1 prérefroidi dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 600 microlitres de la bibliothèque dénaturée et diluée à la position numéro 17 de la cartouche de réactif.

Dans les tubes de microcentrifugation, diluez séparément quatre microlitres de chaque amorce de séquençage avec 636 microlitres de tampon élevé HT1. Ajoutez 600 microlitres d’amorces de séquençage diluées en lecture 1 à la position numéro 18 de la cartouche de réactif de séquençage. 600 microlitres d’amorces de lecture d’index dilué jusqu’à la position numéro 19 et 600 microlitres d’amorces de séquençage diluées de lecture 2 jusqu’à la position numéro 20.

Chargez les réactifs sur l’instrument de séquençage de nouvelle génération et effectuez un séquençage par paires de deux cycles par 150 selon les instructions du fabricant. Enfin, analysez les données de séquençage à l’aide du logiciel bioinformatique compagnon. Au total, 90 échantillons ont pu être traités en une seule exécution NGS à l’aide d’un séquenceur de paillasse.

Pour l’ensemble de données présenté, les échantillons comprenaient des lignées cellulaires, des résidus cliniques formels et fixes intégrés à la paraffine, ou FFPE, et de l’ADN matrice synthétique, et ont permis un séquençage en profondeur élevé et une couverture uniforme. Les valeurs aberrantes comprenaient l’absence de contrôle de matrice, une série de dilution d’un ADN de lignée cellulaire avec une amplification à grand nombre de copies et un ADN FFPE qui a été signalé pour l’inhibition de la PCR par le test de contrôle de la qualité préanalytique basé sur la qPCR. L’uniformité de la couverture sur les 46 amplicons a été maintenue à l’aide de trois opérateurs différents et pour différents échantillons d’ADN FFPE de faible qualité.

Dans le mélange témoin d’ADN tumoral FFPE composé d’une mutation connue de 5 % BRAF V600E, il a été rapporté que la mutation BRAF cible avait une abondance moyenne de 5,2 plus ou moins 1,3 % par trois opérateurs utilisant une entrée de 400 copies amplifiables. Les dilutions d’échantillons de lignées cellulaires et d’ADN FFPE avec amplifications du nombre de copies ont démontré une dépendance pour l’amplification de l’EGFR et du KRAS. De manière importante, l’entrée d’ADN FFPE pourrait être réduite à aussi peu que 50 copies amplifiables ou 1,2 nanogramme d’ADN en vrac.

Tout en préservant la détection des mutations connues sans aucun appel de faux positifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 11 heures avec environ trois heures et demie de temps pratique pour un lot de 24 échantillons à la fois, si elle est exécutée correctement.