Name: Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektionstechnik zur Erzeugung transgener und genomeditierter Dreistachliger Stichlinge. Diese Methode ermöglicht funktionelle Genanalysen in Entwicklungs- und Evolutionsgenetik.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH R01 # DE021475 (CTM), ein NIH Predoctoral Ausbildungsbeihilfe 5T32GM007127 (PAE) und ein NSF Graduate Research Fellowship (NAE) gefördert. Wir danken Kevin Schwalbach für die Durchführung BAC Recombineering und Injektionen, Nick Donde zur Erzeugung von Sequenzierungsdaten CRISPR Sanger und Katherine Lipari für hilfreiche Rückmeldung über die Injektionsprotokoll.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Injizieren einer Zell stickleback Embryonen für die Transgenese oder Genom Bearbeitung präsentiert drei wichtigsten Herausforderungen. Zuerst in Bezug auf Genaktivität, die stickleback embryonalen Chorion ist hart und wird oft Nadeln brechen. Dieses Problem kann teilweise durch Verwendung dicker und stärker Glasmikropipetten und Einspritzen senkrecht zur Chorion (siehe Protokoll, 2) überwunden werden. dass so wenig Wasser wie möglich sichergestellt wird, zu den Embryonen hinzugefügt (gerade genug, um da...

Ein wesentlicher Bestandteil der das Verständnis, wie die biologische Vielfalt entsteht, wird die genetischen und entwicklungs Basen entwickelt phänotypische Veränderungen in der Natur zu bestimmen. Die Dreistachliger Stichling Fisch, Gasterosteus aculeatus hat als hervorragendes Modell entstand für die genetische Grundlage der Evolution zu studieren. Stichlinge haben viele adaptive evolutionäre Veränderungen erfahren , wie Meeresfische unzählige Süßwasser - Umgebungen auf der ganzen nördlichen Hemisphäre besiedelt haben, in dramatischen morphologischen resultierenden, physiologische und Verhaltensänderungen 1. Den Genomen von Individuen 20-1 stickleback Populationen sequenziert und zusammengesetzt wurden und eine hohe Dichte Kopplungskarte erzeugt wurde , um die Baugruppe 2,3 noch weiter zu verbessern. Die genetische Kartierung Experimente haben genomischen Regionen identifiziert entwickelt Phänotypen zugrunde liegenden 4 - 6, und in einigen Fällen haben die funktionelle Rolle von spezifischen Kandidatengene wurden 7,8 getestet. Eine Reihe von Genomregionen morphologischen Veränderungen zugrunde liegen , wurden mit vielversprechenden Kandidaten - Gene identifiziert, aber diese Kandidaten noch nicht funktionell 9 getestet - 12. Darüber hinaus Stichlinge sind gemeinsame Modelle für Untersuchungen der Populationsgenetik / Genomik 13,14, Speziation 15, Verhalten 1, Endokrinologie 16, Ökotoxikologie 17, Immunologie und Parasitologie 18 19. Zukünftige Untersuchungen in jedem dieser Felder wird von der Fähigkeit profitieren funktionelle genetische Manipulationen in sticklebacks auszuführen. Neben ihrer kodierenden Sequenzen zu manipulieren, können die Rollen von Kandidatengenen durch das Studium ihrer cis - Aufsichtsrechtliche Sequenzen und funktionell steigend, fallend oder Eliminierung der Expression des Kandidatengens zu beurteilen. Mikroinjektions und Transgene Methoden in Stichlinge sind gut 7,8,20 etabliert und wurden ursprünglich entwickelt , unter Verwendung einer Meganuclease-vermittelte21 Verfahren zuerst in Medaka 22 beschrieben. Das modifizierte Mikroinjektions hier vorgestellten Verfahren ist gleichermaßen für Tol2-vermittelte Transgenese optimiert und vor kurzem Genome Editing Reagenzien einschließlich Talens und CRISPRs entwickelt. Änderungen an cis Aufsichtsrechtliche Elemente sind gedacht , um morphologische Entwicklung kritisch zu sein, als cis Aufsichtsrechtliche Veränderungen 23 die negativen pleiotrope Auswirkungen von Codierungs Mutationen vermeiden. Aus diesem Grund hat die Prüfung und den Vergleich mutmaßliche cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen ein zentrales Ziel einer zunehmenden Zahl von Evolutionsstudien werden. Darüber hinaus sind die meisten Menschen eine Krankheit Varianten regulatorischen Varianten 24,25 und Modellwirbel Systeme sind sehr cis Aufsichtsrechtliche Element Funktion und Logik erforderlich , um zu studieren. Fische , die ihre Embryonen von außen in großer Zahl befruchten bieten leistungsstarke wirbel Systeme cis -Regelung zu studieren. Die Tol2 Transposon System, bei dem foreign DNA in das Genom integriert werden soll , wird flankiert von Tol2 Transposase Websites und Bindung koinjizierten mit Tol2 Transposase mRNA arbeitet, mit hoher Effizienz für die erfolgreiche Integration von Plasmid in Fisch - Genome - Konstrukte 26 - 28. Typischerweise wird ein potentieller Enhancer stromaufwärts von einem basalen Promotor kloniert (wie hsp70l 29) und fluoreszierendes Reportergens wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder mCherry in einem Tol2 Rückgrat und injizierte mit Transposase mRNA 26. Die Beobachtung der Expression des fluoreszierenden Reporter, entweder in injizierten Embryonen oder Nachkommen mit stabil integrierten Transgene, liefert Informationen über die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression durch die vermeintliche Enhancer angetrieben. In weiteren Experimenten validiert Enhancer verwendet werden gewebespezifische Überexpression von Genen von Interesse zu fahren. Für die Analyse von größeren cis Aufsichtsrechtliche Regionen, hochwertige Großeinsatz genomic Bibliotheken bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) verwendet haben 30 für beide Meeres- und Süßwasser Stichlinge gebaut. Diese BACs kann recombineered ein Gen mit einem fluoreszierenden Reporter - Gen in Zusammenhang mit einer großen (150-200 kb) genomischen Region 31 zu ersetzen. Die fluoreszierenden Reporter wird dann in einem Raum-Zeit-Muster ausgedrückt als durch regulatorische Sequenzen innerhalb des BAC bestimmt. Für Studien in Fisch kann Tol2 Sites zur BAC hinzugefügt werden 32,33 genomische Integration zu erleichtern. In späteren Stadien der Entwicklung , wenn in situ Hybridisierung technisch anspruchsvoll ist, kann die Fluoreszenz Auslesen des BAC verwendet werden , um Muster der Genexpression zu untersuchen, wie sie für stickleback Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) 20 gezeigt. Zusätzlich können fluoreszierende Expressionsmuster in einem Individuum über die Zeit verfolgt werden, die nicht mit in situ Hybridisierung durchgeführt werden. BACs auch eine additiona hinzuzufügen verwendet werdenl Kopie einer genomischen Region Dosierung eines Gens von Interesse zu erhöhen. Zur Untersuchung der Genfunktion, Genom Bearbeitung ist eine explosionsartig expandierenden Bereich, der verwendet werden kann , gezielt Änderungen an genomische Sequenzen in einer Vielzahl von Organismen , 34 zu erzeugen. Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) sind modular aufgebaut, sequenzspezifische Nukleasen ursprünglich aus Pflanzenpathogene isoliert , die genau direkt zu einer genomischen Sequenz der Wahl zu binden , konstruiert werden können , und ein Doppelstrang 35,36 brechen erzeugen. Clustered regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS - Systeme wurden ursprünglich in Bakterien gefunden und eine Führung RNA verwenden und die Cas9 Protein eine Pause in einer Ziel - DNA - Sequenz , die komplementär zu der Führung 37 zu erzeugen. Die anschließende Reparatur des Doppelstrangbruchs beiden erstellt von TALENS und CRISPRs hinterlässt häufig eine kleine Insertion oder Deletion, die die Funktion der Zielsequenz stören können35-37. In Stichlinge wurden Talens verwendet Genexpression stören durch einen Verstärker 20 Targeting, und beide Talens und CRISPRs wurden in kodierenden Sequenzen (nicht veröffentlichte Daten) erfolgreich Mutationen erzeugt. Ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von CRISPRs für den Einsatz in Zebrabärbling als Richtlinie verwendet werden 38 CRISPRs für Stichlinge zu entwickeln. Transgene und Genombearbeitungs Experimente erfordern Einführung von Nukleinsäuren in eine neu-Zellen embryo gedüngt. Durch Einführen des Transgens oder Genom-Bearbeitungswerkzeug früh in der Entwicklung, die Anzahl von genetisch manipulierten Tochterzellen im Embryo maximiert. Injizierten Embryonen werden dann visuell auf Fluoreszenz abgeschirmt oder molekular für Genom-Modifikationen durchmustert. Wenn Zellen zu der Keimbahn beitragen erfolgreich ausgerichtet sind, kann das Transgen oder Mutation werden, um eine Untergruppe von Nachkommen weitergegeben, auch wenn Nacheinspritzung Lethalität hoch ist. Die Mosaik-Fisch kreuzt werden kann, oderintercrossed und deren Nachkommen gesiebt, um die mutierten Allele oder ein stabil integriertes Transgen von Interesse zu erholen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für Transgene und Genom Bearbeitung von Reagenzien in einer Zell stickleback Embryonen und Überwachung für eine erfolgreiche genomischen Änderungen.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop mit Durchleuchtung</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Manueller Mikromanipulator</td><td>Angewandte Wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Mikromanipulator</td></tr><tr><td>Druckinjektionssystem</td><td>Angewandte Wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Gegendruckeinheit</td><td>Angewandte Wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter-Kit</td><td>Angewandte Wissenschaftliche Instrumente</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetfußhalter Angewandte</td><td>Wissenschaftliche Instrumente</td><td>Magnetfuß</td><td></td></tr><tr><td>Fußschalter</td><td>Angewandte Wissenschaftliche Instrumente</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Eisenplatte (Magnetfuß)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Braun Mikropipette Abzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Phenolrot in DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>Injektions-Tracer</td></tr><tr><td>#5 Pinzette, biologie dumoxel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>zum Brechen</td></tr> von <tr><td>Nadeln Mikropipetten-Vorratsdose</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>hält Nadeln</td></tr><tr><td>6", 6 Zähne pro Zoll Gips-Trockenbausäge</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>Hält Eier für die Injektion</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm Glasplatte</td><td>jeder Baumarkt</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Borosilikatglas Kapillaren, 1,0 mm OD / 0,58 mm ID & nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*härteres Glas als Zebrafisch-Injektionskapillaren</td></tr><tr><td>150 x 15 mm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>Aufzucht von Stichlingsembryonen</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>Lagerung von Eiern vor</td></tr> der <tr><td>Injektion Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>Fischanästhesie/Euthanasie</td></tr><tr><td>Sp6 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Für die Transkription von TALENs und Transposase mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Aufreinigung von Transposase oder TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Aufreinigung von Plasmiden für Injektion</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>für die DNA-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Nukleobond BAC 100 Kit</td><td>Clontech</td> 740579 <td>für die BAC DNA-Vorbereitung</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polymerase</td><td></td><td>Fisher F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>enthält Endotoxin-Spülpuffer</td></tr><tr><td>QIAQuick Gel-Extraktion</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>zur Sequenzierung induzierter Mutationen</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molekularbiologische Qualität)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-Acetat-EDTA-Puffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0,5-10 Kb RNA-Leiter</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanotropfen&nbsp; Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA Leiter</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8,3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-Streifen-PCR-Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroinjektions für transgenese und genome editing in threespine stichlinge

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Die Dreistachliger Stichling Fisch hat sich als leistungsfähiges System entstanden, die genetische Basis einer Vielzahl von morphologischen, physiologischen und verhaltens Phänotypen zu untersuchen. Die bemerkenswert unterschiedlichen Phänotypen, die sich entwickelt haben als die Populationen im Meer zu unzähligen Süßwasser-Umgebungen anzupassen, kombiniert mit der Fähigkeit Meeres- und Süßwasserformen zu überqueren, bieten einen seltenen wirbel System, bei dem Genetik verwendet werden können genomische Regionen abzubilden Züge entwickelt steuern. Ausgezeichnete genomische Ressourcen sind ab sofort verfügbar, molekulargenetische Dissektion entwickelt Änderungen zu erleichtern. Während Kartierungsexperimente Listen interessante Kandidatengene erzeugen, sind funktionelle genetische Manipulationen erforderlich, um die Rolle dieser Gene zu testen. Die Genregulation können mit transgenen Reporter Plasmide und BACs integriert in das Genom untersucht werden, unter Verwendung des Tol2 Transposase-System. Funktionen von spezifischen Kandidatengene und cis - Aufsichtsrechtliche Elemente können durch Induktion gezielt beurteilt werdenMutationen mit TALEN und CRISPR / Cas9 Genome Editing Reagenzien. Alle Methoden erfordern Nukleinsäuren in befruchtete eine Zelle stickleback Embryonen Einführung machte eine Aufgabe, durch die dicke Chorion von stickleback Embryonen herausfordernd und die relativ kleinen und dünnen Blastomere. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Nukleinsäuren in stickleback Embryonen für transgene und Genombearbeitungsanwendungen beschrieben Genexpression und Funktion zu untersuchen, ebenso wie Techniken, um den Erfolg der Transgenese zu bewerten und stabile Linien wiederherzustellen.

Für Reportergen Transgenen , die Enhancer - Aktivität aufweisen, führt erfolgreiche Injektion in spezifische, zelluläre Expression des Transgens (4A, 4C). Eingespritzte Fische können dann kreuzt werden , um stabile Linien (Beispiel einer BAC stabilen Linie in 4B gezeigt) zu erzeugen. Die Injektion von DNA in stickleback Embryonen führt in der Regel weit höher Letalität als RNA allein. Es ist typisch auf 50% zu sehen , nach oben (manchmal...

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroinjektionstechnik besteht darin, transgene und genomeditierte Stichlinge zu erzeugen, um die Funktion von Genen und Enhancern zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungs- und Evolutionsgenetik zu beantworten, beispielsweise wie Gene und Enhancer zur Ausbildung von Körpermustern beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie effizient transgene Fische für die funktionelle genetische Analyse erzeugt.Nach der Herstellung von zwei Plasmiden und mRNA gemäß dem Textprotokoll ziehen Sie mindestens vier Mikropipettenspitzen aus Borosilikatglas. Lagern Sie diese vertikal in einem Kapillarlagertiegel mit den spitzen Enden nach unten. Um bis zu einhundert Stichlings-Eier zu befruchten, geben Sie 50 Mikroliter Spermienlösung hinzu und rühren vorsichtig mit einer Pipettenspitze um, um sicherzustellen, dass alle Eier befruchtet werden.Während der Arbeit auf Eis füllen Sie mindestens drei Nadeln auf, indem Sie 0,5 Mikroliter Injektionslösung in das stumpfe Ende der Nadel pipettieren und ablaufen lassen. In der Zwischenzeit schalten Sie das Durchlicht für das Stereomikroskop ein und legen eine 13 Quadratzentimeter

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Quelle: Chen, S., et al., Stereotaxische Chirurgie zur genetischen Manipulation in striatalen Zellen von Neugeborenen-Mausgehirnen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, der für Cre-Rekombinase und grünes Fluoreszenzprotein (GFP) kodiert, in das Striatum eines genetisch veränderten Maus-Welpen, um eine Genmanipulation zu erreichen, indem eine loxP-flankierte STOP-Kassette herausgeschnitten und das rote Fluoreszenzprotein oder RFP als Reporter...

Stereotaktische Mikroinjektion eines viralen Vektors zur Genmanipulation in einem Striatum eines Maus-Jungtiers

Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Eine einfache und effiziente Mikroinjektion Protokoll zur gen Bearbeitung im Channel Catfish Embryonen mit dem CRISPR/Cas9-System wird vorgestellt. In diesem Protokoll führen RNAs und Cas9 Protein wurden in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert. Dieses Protokoll wurde bestätigt durch zwei Channel Catfish immunvermittelte Gene ausschlagen.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Zeckenembryonen. Die Embryoinjektion ist die bevorzugte Technik zur genetischen Manipulation, um transgene Linien zu erzeugen.

Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 und Spender-DNA durch Zygoten, um effizient Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Mäuse zu produzieren.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Lernen Sie die Mikroinjektionstechnik zur Erzeugung transgener und genomeditierter Dreistachliger Stichlinge. Diese Methode ermöglicht funktionelle Genanalysen in Entwicklungs- und Evolutionsgenetik.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

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