设计和适体 - 金纳米粒子基于比色法的开发在这领域的应用

总体目标是为开发基于适配体-金的纳米颗粒比色测定法提供一种通用方法，用于检测靶分子，并提供改善长期存储和降低假阳性反应率的方法。该方法回答了金纳米颗粒再聚体比色分析领域的关键问题，如长期储存检测的现场重复性及降低假阳性反应率。这些检测方法容易存在保质期和假阳性问题。

在这项工作中，我们对这两个问题进行了改进。在化学安全罩内，用5毫升浓硝酸和15毫升浓盐酸清洗500毫升Erlenmeyer小瓶和大搅拌棒。用酸洗液把整个烧瓶表面都弄湿。

然后用无核酸酶水冲洗烧瓶，让烧瓶干燥。加入100毫升一毫莫拉金三氯化物。用铝箔覆盖酸洗过的埃伦迈耶烧瓶顶部，在热板上连续搅拌加热直到沸腾。

接着，加入10毫升38.8毫莫拉柠檬酸钠。颜色会在几分钟内从清澈或灰色变为深蓝色或黑色，最终变成深红色。关火继续搅拌10分钟。

让金纳米颗粒悬浮液冷却至室温，并连续搅拌加入110微升DEPC。用铝箔纸覆盖整个烧瓶，让DEPC处理过夜。第二天，用高压灭菌处理金纳米颗粒悬浮液。

然后冷却至室温，过滤0.22微米孔径的醋酸纤维素膜。将过滤后高压灭菌的金纳米颗粒液存放在四摄氏度的黑暗中。按照文本协议中描述计算金纳米颗粒浓度。

这里，通过动态光散射计算出浓度为10纳摩尔，尺寸为15纳米。购买或合成可卡因结合的适配体序列，使用标准磷酰胺化学材料。在用标准脱盐纯化适配体后，在无核酸酶水中以100微摩尔或1毫莫尔的液体重新合成寡核苷酸。

提取的纯化适体可在20摄氏度下储存数月。将DNA与10纳摩尔金纳米颗粒溶液结合，根据需要调整金纳米颗粒的体积，以提供足够的样本进行检测。将混合物在室温下孵育三到四小时，并避免光照照射。

加入等量的20毫莫拉HEPES、两毫莫拉氯化镁和pH 7.4缓冲液，并将样品置于四摄氏度的黑暗中过夜。通过测定空白法确定诱导测定染色反应所需的初始盐浓度。在96孔板中，向适配体-金氯化物测定法的180微升分度中加入20微升甲醇。

这些检测执行的关键步骤是确定氯化钠浓度，以在靶标添加后使金纳米颗粒不稳定。用增加容量的氯化钠溶液滴定样品，确定当量点。在这里，通过目视观察确定引起最细微颜色变化所需的氯化钠体积。

为优化测定响应，在室温下96孔板中，将20微升甲醇稀释的分析物分子加入180微升的适配体-金纳米颗粒测定。立即加入前一步确定的氯化钠浓度，启动测定的颜色响应。通过增加或减少氯化钠浓度，并将目标响应与空白反应进行比较，获得最大颜色变化。

使用反应差异最大的氯化钠浓度。观察或测量氯化钠添加后150秒的检测反应。使用分光光度计分析650纳米和530纳米的吸收率。

将结果绘制为650纳米和530纳米吸收率随分析物浓度的函数。对空白信号的检测反应进行归一化。准备视频中描述的即用金纳米颗粒测定组分。

在无核酸酶水中分别制备含有每毫升海藻糖1克和蔗糖1克的溶液，制成低温溶液。因此，冷冻这些检测的关键一步是确定样品中应添加多少海藻糖和蔗糖溶液，以确保完全且均匀冷冻。在1.5毫升微离心管中，用每金纳米颗粒分析60 MN4，最终体积为200微升，制备含19.2毫克海藻糖和4.8毫克每毫升蔗糖的溶液。

最终低温溶液的浓度会随DNA覆盖而变化。用146摄氏度的冷冻室或液氮速冻样品。样品冷冻保存，直到使用。

为此，将样品置于146摄氏度的冷冻库中过夜，然后转移到20摄氏度的冷冻柜进行长期保存。这里展示了未处理和DNA适配体处理金纳米颗粒的氯化钠滴定曲线的代表性结果。检测中使用的初始氯化钠浓度通过滴定确定。

此处展示了可卡因和对照分子的拟合体-金纳米颗粒比色测定的代表性结果。图表显示，增加DNA覆盖密度对可卡因检测假阳性率的影响。这里展示了可卡因比色测定的光像分析所得的校准曲线图。

使用智能手机拍摄的照片。这里展示了适配体-金纳米颗粒比色测定对可卡因和对照分子的代表性反应。数据比较了新鲜制备的样本与冷冻保存长达四周的样本。

在尝试此程序时，确定适当的氯化钠浓度非常重要，以使金纳米颗粒不稳定，并促进靶材加入时的典型颜色变化。看完这个视频后，你应该能很好地理解如何开发金纳米颗粒适配体比色测定法，用于检测目标目标。你可以利用这里列出的方法来降低假阳性反应率，并让你的检测结果持续一个多月。