Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Bonjour, je m’appelle Cécile. Je travaille au LGBP à Marseille. Le protocole que nous allons décrire dans cette vidéo est une méthode simple pour isoler les polysomes et les monosomes de divers tissus végétaux afin d’identifier les ARNm qui sont activement traduits et d’étudier la régulation de la traduction.

À titre d’exemple, nous allons vous montrer l’isolement des polysomes de semis d’Arabidopsis thaliana âgés de six jours, l’isolement ultérieur de l’ARN et l’analyse des résultats. Semez les graines sur une assiette et laissez-les deux jours à quatre degrés. Ensuite, faites pousser les plantes pendant six jours.

Récoltez les plants et broyez-les dans de l’azote liquide. Poids 300 milligrammes de poudre de plante et ajouter 2,4 millilitres de tampon polysome. Centrifuger pour collecter des fragments de plantes et charger le surnageant au sommet d’un gradient de saccharose.

Le gradient de l’ultra-centrifugeuse le collecte ensuite de bas en haut avec lecture continue de la DO. Tirez la fraction dans un polysome, un monosome et une fraction surnageante et précipitez l’ARN pendant la nuit. Ultra-centrifuger, remettre en suspension la pastille et extraire l’ARN pour une analyse ultérieure. Quelques jours avant d’effectuer le profilage des polysomes, préparez le gradient de saccharose.

Préparez une solution de saccharose à 50, 35 et 20 % et maintenez-les à quatre degrés. Versez la couche de saccharose à 50 %. Congelez-le dans un congélateur à moins 40.

Après six heures, ajoutez la couche de 35 % et congelez-la dans un congélateur à moins 40 pendant la nuit. Versez la première couche de 20 % et congelez-la. Le jour de l’expérience, retirez le nombre nécessaire de gradients du congélateur.

Ajoutez les 20 % restants de saccharose et laissez les dégradés dégeler dans une chambre froide. Préparez l’échantillon que nous avons fraîchement collecté pour la plante. Ici, nous utilisons des semis d’Arabidopsis thaliana âgés de six jours.

Récoltez les plantes congelées à l’azote liquide et broyez-les soigneusement. Poids 300 milligrammes de poudre de plante. Ajouter rapidement 2,4 millilitres de tampon de polysome frais et homogénéiser.

Pipetez la solution dans deux tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger l’extrait cytosolique. Pipeter le surnageant.

Attention à éviter les fragments de plantes. Ils gâcheraient le profil à l’étape suivante. Chargez le surnageant sur le gradient de saccharose sans perturber le gradient.

Mettez la pente dans un godet rotor SW 41. Centrifugeuse. Pour visualiser le profil des polysomes et collecter la fraction, nous utilisons un système simple composé d’un tube capillaire qui plonge dans le gradient. Il est relié à une cuvette UV.

Il est auto-connecté à une pompe péristaltique. Un spectrophotomètre UV enregistre en continu le DO au fur et à mesure que le gradient progresse dans la cuvette. Le collecteur de fractions permet de collecter des fractions de deux millilitres.

Nettoyez la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre. Retirez la pente du godet sans le déranger. Les chlorophylles doivent être concentrées sur le haut du gradient.

Plongez les tubes capillaires vers le bas de la pente. Démarrez la pompe péristaltique. Le gradient est collecté de bas en haut et le diamètre extérieur est lu en continu.

Deux fractions de millilitres sont recueillies. Voici la forme d’un profil classique. La précipitation de l’ARN est effectuée à l’aide de chlorhydrate de guanidinium et d’isopropanol.

Tout d’abord, versez un volume de chlorhydrate de guanidinium dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez la fraction. Ajoutez ensuite 1,5 volume d’isopropanol et 50 microgrammes de courrier égal. Faites précipiter l’ARN pendant la nuit à moins 20 degrés.

Transférez les fractions dans des tubes ultra-centrifuges de 40 millilitres et équilibrez le tube avec de l’isopropanol. Centrifugeuse. Retirez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air. Remettez le granulé en suspension dans 200 microlitres de tampon TE chaud.

Extrayez ensuite l’ARN en effectuant une extraction classique au phénol chloroforme. Un profil représentatif de l’extrait de polysomes d’un semis d’Arabidopsis âgé de six jours est présenté ici. Le pic principal correspond au monosome, les ARNm qui sont associés à un seul ribosome.

La première partie du profil correspond aux fractions polysomiques à savoir l’ARNm associé à de nombreux ribosomes. Chaque pic correspond à l’association du nouveau ribosome à l’ARNm. La dernière partie du profil correspond à la fraction surnageante qui contient les sous-unités ribosomales libres et l’ARN.

Une grande quantité de sous-unité 60S forme une épaule à côté du pic du monosome. Pour évaluer leur intégrité, les ARN extraits des fractions peuvent être analysés sur un gel d’Aragose classique avant d’être utilisés pour d’autres expériences. Nous avons utilisé ce protocole pour isoler les polysomes des semis d’Arabidopsis thaliana, mais aussi des rosettes jeunes et âgées ainsi que des feuilles de Nicotiana benthamiana, de tomates et de riz, de sorte qu’il devrait fonctionner avec un large éventail de plantes et de tissus.

Les ARN purifiés sont compatibles avec l’analyse par micropuces ainsi que pour l’identification de petits ARN associés à des fractions polysomiques.