Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы спектроскопически проследить неестественную связь между двумя белками, индуцированную синтетическим химическим преобразователем. Они продемонстрируют возможность создания синтетических аналогов сигнальных белков, которые смогут осуществлять пути передачи сигнала, не встречающиеся в природе. Возможность отслеживать неестественную коммуникацию между белками с помощью обычного спектрофотометра может помочь в развитии и улучшении функции искусственных химических преобразователей и приблизить нас к достижению искусственной сигнальной трансдукции.

Химический преобразователь состоит из тромбоцитарного фактора роста, или аптамера PDGF. Двухвалентный этакриновый ингибитор амида GST, флуорофор и гаситель. Синтез химического преобразователя не будет продемонстрирован в этом видео.

Но описано в текстовом протоколе. Принципы работы химического преобразователя проиллюстрированы здесь. Химический преобразователь ингибирует ферментативную активность GST, когда две группы EA связывают активные центры ферментов.

Добавление PDGF приводит к образованию комплекса химических преобразователей PDGF. Что нарушает взаимодействие преобразователя с GST, тем самым восстанавливая ферментативную активность GST. Последующее добавление немодифицированного аптамера PDGF высвобождает химический преобразователь и позволяет ему повторно ингибировать фермент.

Перед началом экспериментов по изучению контроля активности GST с помощью PDGF, настройте экспериментальную процедуру в считывателе пластин для измерения кинетики. Создайте новый эксперимент в качестве стандартного протокола. Выберите «Процедура», чтобы открыть окно «Настройки процедуры».

Во всплывающем списке в верхней части окна выберите тип пластины 384 в соответствии с производителем пластины. Выберите «Читать» в меню слева. Выберите абсорбцию в качестве метода обнаружения.

и конечная точка для типа чтения. В окне Длина волны введите 340 нанометров. Выберите Full Plates (Полная пластина) и выберите скважины для измерения.

Затем нажмите кнопку «ОК», чтобы закрыть окно «Чтение». В меню слева выберите «Запустить кинетику». Установите Время выполнения (Run) равным 10 минутам.

Выберите опцию «Минимальные интервалы». Затем нажмите OK, чтобы закрыть окно Kinetic. Перетащите линию считывания в кинетическое измерение.

Нажмите кнопку «Подтвердить», а затем кнопку «ОК». Сохраните эксперимент. Нажмите кнопку «Воспроизвести».

Появится диалоговое окно, но не нажимайте кнопку OK, пока не будете готовы начать кинетическое измерение. После того, как считыватель планшетов настроен, следующим шагом является подготовка образцов для измерения активности GST в присутствии химического преобразователя и PDGF. Чтобы проверить четыре концентрации PDGF в трех концентрациях, подготовьте четыре образца, каждая из которых содержит 3,25 микролитра химического преобразователя и 3,25 микролитра GST M-1.

Добавьте в каждый образец ноль, 1,2, 2,4 или 4,9 микролитра PDGF соответственно. Затем добавьте соответствующий объем буфера для анализа к каждому образцу, чтобы довести общий объем до 130 микролитров. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут.

Через 10 минут перелейте по 40 микролитров каждого образца в лунки 384 прозрачной луночной пластины. Перенесите каждый из четырех образцов в четные или четные лунки только в одном ряду. Чтобы можно было использовать мультипипеттер для добавления субстрата.

Затем с помощью 12-канального мультипипеттера быстро добавьте к каждому образцу по 10 микролитров каждого субстрата, предварительно подготовленного в 96-луночной пластине. Перемешивайте быстро, но аккуратно, чтобы не было пузырьков. Немедленно вставьте пластину в считыватель пластин и начните кинетическое измерение, нажав кнопку OK в диалоговом окне.

Для изучения циклов ингибирования активации GST, опосредованных химическим преобразователем, подготовьте пять образцов, каждый из которых содержит 84,5 мкл буфера для анализа, 3,25 мкл химического преобразователя и 3,25 мкл GST M1-1. Выдерживать при комнатной температуре в течение трех минут.

Добавьте 3,65 микролитра буфера для анализа в первый образец и 3,65 микролитра PDGF во второй, третий, четвертый и пятый образцы. Выдерживать при комнатной температуре в течение трех минут. Добавьте 3,12 микролитра буфера для анализа в первый и второй образцы и 3,12 микролитра аптамера PDGF в третью, четвертую и пятую пробы.

Выдерживать при комнатной температуре в течение трех минут. Добавьте 24,4 микролитра буфера для анализа в первый, второй и третий образцы. И 24,4 микролитра PDGF на четвертый и пятый образцы.

Выдерживать при комнатной температуре в течение трех минут. Добавьте 7,8 микролитров буфера для анализа в образцы с первого по четвертый и 7,8 микролитров аптамера PDGF в пятый образец. Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут.

Перенесите образцы в прозрачную луночную пластину 384. Выполнить эксперимент можно в трех экземплярах, и быстро добавить субстрат к образцам. Вставьте пластину в считыватель и начните кинетическое измерение.

Чтобы начать этот анализ, настройте экспериментальную процедуру в считывателе планшетов для кинетического измерения, как описано в тексте протокола. Подготовьте два образца в двух лунках 384 прозрачной луночной пластины. Для каждой лунки смешайте один микролитр GST M1-1 и один микролитр химического преобразователя в 38 микролитрах буфера для анализа.

Оставьте пустую лунку между двумя лунками. С помощью 12-канального мультипипеттера быстро добавьте в каждую лунку по 10 микролитров субстрата. И аккуратно и быстро перемешивайте, чтобы не было пузырьков.

Немедленно вставьте пластину в считыватель и начните кинетическое измерение. Когда считыватель пластин откроется через 3,5 минуты, быстро добавьте 1,125 микролитра PDGF в одну из лунок, аккуратно перемешайте и дайте пластине снова войти в считыватель для остальных кинетических измерений. Перед подготовкой образцов к этому эксперименту настройте экспериментальную процедуру в считывателе пластин для измерения кинетики, как описано в тексте протокола.

Для измерения выработки оксида азота будет использоваться колориметрический набор для нитритов/нитратов. В планшете на 96 лунок нанесите 50 микролитров буфера для анализа на лунку в первый ряд. 70 микролитров реагента Griess One на лунку во второй ряд.

И по 70 микролитров реагента Griess Two на лунку в третий ряд. Подготовьте четыре образца, каждый из которых содержит 4,8 микролитра химического преобразователя. Для отбора одного из них добавьте 155,2 микролитра буфера для анализа.

Для второго образца добавьте 3,2 микролитра GST M1-1 и 152 микролитра буфера для анализа. В третью пробу добавьте 9,6 микролитров PDGF, и 145,6 микролитров буфера для анализа. А к четырем образцам добавьте 3,2 микролитра GST M1-1, 9,6 микролитра PDGF и 142,4 микролитра буфера для анализа.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. Выдайте 50 микролитров образца на лунку в прозрачную луночную пластину 384, чтобы провести эксперимент в трех экземплярах. Дозируйте образцы только в четные или нечетные лунки в одной и той же линии, чтобы можно было использовать мультипипеттер для добавления субстрата.

Добавьте 0,54 микролитра пролекарства JS-K в каждый образец. Быстро добавьте в каждый образец 10 микролитров раствора глутатиона и аккуратно и быстро перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков. Вставьте пластину в считыватель и начните кинетическое измерение.

Сразу после кинетического измерения перенесите по 50 микролитров каждого образца в каждую лунку первого ряда 96-луночного планшета с буфером для анализа. Затем переложите по 50 микролитров из каждой лунки второго ряда тарелки в лунки первого ряда тарелки. И по 50 микролитров на лунку из третьего ряда тарелки в лунки первого ряда тарелки.

Инкубировать в защищенном от света месте в течение 10 минут при комнатной температуре. До измерения поглощения на 550 нанометров. Измерение активности GST без химического преобразователя и с химическим преобразователем показало, что химический преобразователь ингибирует активность GST.

GST реактивируется путем добавления возрастающих концентраций PDGF в комплекс GST-химического преобразователя. Последовательное добавление PDGF и немодифицированного аптамера PDGF к комплексу GST-химического преобразователя показало, что связь между PDGF и GST является обратимой. Добавление PDGF в комплекс GST-преобразователя приводило к быстрому увеличению активности GST через 3,5 минуты после добавления субстратов.

В то время как добавление аптамера PDGF к смеси GST, PDGF и химического преобразователя приводило к снижению активности GST. Эти результаты указывают на то, что система реагирует в режиме реального времени на изменения в окружающей среде. Впоследствии способность этой системы контролировать активацию пролекарств была исследована с помощью JS-K, противоракового пролекарства, которое активируется GST для высвобождения токсичного оксида азота.

Измерения количества оксида азота, высвобождаемого при добавлении JS-K в химический преобразователь и различных комбинаций GST и PDGF, подтвердили, что только присутствие как GST, так и PDGF активирует JS-K. Все это показывает, как синтетический агент может позволить фактору роста запускать каталитическую активность глутатион-S-трансферазы, которая не является его естественным ферментным партнером. Таким образом, будущие биомиметики этого класса могут быть использованы для изменения реакции клеток на сигналы окружающей среды или придания им новых свойств.