Name: Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: 배우세요 쥐 좌골 신경의 슈반 세포에 전기천공법을 이용한 생체 내 유전자 전달 방법을. 말초신경계의 미엘린화 및 탈미엘린화 분자 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 문부과학성의 M.I.(21229004 및 25221304)에 대한 보조금의 지원을 받았습니다.

연구를위한 쥐의 사용은 도쿄 대학의 동물 복지위원회 설치 지침에 따라이었다. 플라스미드 DNA의 1. 준비 <ol><li> 포유 동물 세포 (12)에 대한 발현 플라스미드로의 cDNA 또는 shRNA를 서열을 서브 클로닝에 의해 생체 전기에 대한 DNA 플라스미드를 생성합니다. 그것은 강력하고 안정적인 표현을 할 수 있기 때문에 사이토 메갈로 바이러스 즉시 초기 증강 및 닭 β - 액틴 프로모터 융합 (CAG) 발기인 중심의 플라스미드 (13)를 사용합니다. CAG 프로모터의 제어하에 발현 shRNA를 들어, shRNA를 14 서브 클로닝하는 mir30 기반 shRNA를 카세트 시스템을 사용한다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 맥시 준비 키트와 플라스미드 DNA를 정화하고, HEPES 완충 식염수 (140 mM의 염화나트륨, 0.75 mM의 나 2 HPO 4, 25 mM의 HEPES, 산도 7.40)와 DNA를 재현 탁. μg의 / μl를 ≥4하는 DNA의 농도를 조정합니다. </li><li&gt; 4 μg의 / μL의 농도로 플라스미드 DNA 용액을 준비하고, 주사 부위에 라벨을 고속 녹색 염료의 최소량 (0.01 %의 최종 농도)을 추가한다. 여러 플라스미드를 동시에 전기가 필요한 경우, 4 μg의 / μL로 플라스미드 DNA 용액의 총 농도를 조정한다. 주 : 플라스미드 DNA의 최적 조성은 각 플라스미드의 형질 감염 효율에 따라 결정되어야한다. </li></ol> 수술 악기와 식염수 2. 살균 <ol><li> 오토 클레이브 수술 도구와 0.9 % NaCl 용액. </li></ol> 글래스 마이크로 피펫 3. 준비 <ol><li> 피펫 풀러를 사용하여 유리 피펫을 당기십시오. 30 ~ 50 ㎛의 직경 피펫의 끝을 잘라. 다음 매개 변수를 사용하여 열, 600; 속도, 50; 시간, 75. </li></ol> 4. 동물 외과, DNA 주입 및 Electroporation에 참고 : 이상을이 단계의 도면은도 1에서 설명한다. 래트 새끼 절차가 여기에 설명되어 있지만,이 방법도 동일한 방법을 사용하여 성숙한 동물에 적용 가능하다. <ol><li> 동물은 4 % (부피 / 부피) 내지 0.4 L / 분, 산소 흐름 및 이소 플루 란 농도를 조정하여 부동 될 때까지 유도 상자에 이소 플루 란 마취 래트. 적절한 마취를 확인하기 곤란 발가락을 수행합니다. </li><li> 쌍안 현미경으로 데워진 따뜻한에 쥐를 넣고 계속 얼굴 마스크를 통해 이소 플루 란을 투여하여 마취를 유지한다. 2 % (부피 / 부피) 0.2 L / 분 산소 흐름과 이소 플루 란 농도를 조정합니다. 사용 눈은 동물의 눈이 열린 경우 눈의 건조를 방지하는 방울. </li><li> 수술 테이프로 다리를 고정합니다. </li><li> 포비돈 - 요오드와 후방 허벅지의 피부를 청소하고, 메스와 절개를합니다. 참고 : 외과 영역이 시간에 해당되는 경우 수술 영역을 면도공기. </li><li> 사두근 사이의 개방 근육 대퇴 이두근과는 바느질 바늘로 근육을 대퇴 작성하여 좌골 신경을 노출. </li><li> 0.9 % NaCl 용액으로 신경 젖은. 보풀이없는 종이로 여분의 물을 흡수한다. </li><li> 유연한 튜브에 유리 마이크로 피펫의 기초를 넣고 부드럽게 흡입하여 마이크로 피펫으로 DNA 용액 (하나 이상의 마이크로 리터)의 적절한 양을 입력합니다. </li><li> 조심스럽게 바늘을 사용하여 신경의 말단면을 당겨 노출 된 신경를 들어 올립니다. 참고 : 기계적 스트레스를 최소화하기 위해 신경에 긴장을 적용하지 마십시오. </li><li> 신경의 말단 부위에 유리 마이크로 피펫을 삽입하고 적용 압력에 의해 DNA 용액을 주입 (플렉시블 튜브의 개방 단부에 불어 즉). 신경이 녹색 (1 μL의 최대)이 나타날 때까지 DNA 용액을 주입한다. 마이크로 피펫의 빈번한 삽입 신경에 손상을 줄 수 있기 때문에, 두 배 이상 마이크로 피펫 더 넣지 마십시오. </li><li> TWE 배치에셀 형 약 1-2mm 떨어져 신경에서 백금 전극. 전극과 0.9 % NaCl 용액과 신경 사이의 간격을 입력합니다. 참고 : 신경에 기계적 스트레스를 피하기 위해 전극과 신경을 잡지 마십시오. </li><li> 전극과의 electroporator를 사용하여 주사 부위에 전기 펄스를 적용합니다. 첫 번째 펄스 설정 한 후, 전극을 반전하고 다른 펄스 설정을 적용합니다. 다음 매개 변수를 사용하여 전압이 50 V를; 펄스 지속 시간 5 밀리 초; 펄스 간격이 100 밀리 초; 펄스 수, 4 번. </li><li> 0.9 % NaCl 용액으로 전기 사이트를 청소합니다. </li><li> 반복 반대측 좌골 신경에 4.4-4.11 단계를 반복합니다. </li></ol> 5. 후 전기 <ol><li> 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 절개를 닫습니다. </li><li> 접착제를 건조시킨 후, 포비돈 - 요오드 상처를 청소하십시오. </li><li> 얼굴 마스크의 강아지를 놓습니다. 완전히 마취에서 회복 할 수 있도록하기 위해 시간 동안 적어도 따뜻한에서 강아지를 따뜻하게. 디충분한 의식을 회복 할 때까지 O를 강아지를 방치하지. </li><li> 마취에서 회복 후, 어머니 쥐에 강아지를 반환합니다. 완전히 회복 될 때까지 강아지를 반환하지 않습니다. </li></ol> 6. 수술 후 <ol><li> (그림 3의 예를 참조) 실험 (11)을 수행 할 때까지 케이지의 집은 쥐 새끼. 카프로 펜 투여 (5 ㎎ / ㎏을, IP), 비 - 스테로이드 계 소염 약물, 또는 프레 노르 핀 (0.1 밀리그램 / kg, SC) 아편 유사 진통제, 필요한 경우. 주 : 래트 새끼 잘 성장하지 않는 염증 수술 부위 주위에 관찰되는 경우, 실험 동물을 제외. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문에서는 전기천공법을 사용하여 쥐 좌골 신경의 수초성 SC로 생 체 내 유전자 전달을 허용하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 플라스미드 DNA가 주입된 좌골 신경에 전기 펄스를 적용하기만 하면 수초성 SC에서 고도로 선택적인 유전자 발현을 허용합니다. 말초 신경계에서 수초화와 탈수초화의 분자 메커니즘이 불분명하기 때문에 현재의 생체 내 전기천공 방법은 살아있는 동물에서 관심 있는 여러 유전자의 역할을 명확히 하는 강력한 도구가 될 것입니다.
이 방법의 중요한 요구 사항은 수술 중 신경 손상을 최소화하는 것입니다. 외과적 손상으로 인해 과도한 염증이 발생하면 좌골 신경이 퇴화될 수 있습니다. 이를 피하기 위해서는 신경 주변의 혈관이 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여 수술을 해야 합니다. 수술 중 신경에 가해지는 기계적 스트레스도 신경 손상의 원인이 될 수 있습니다. 기계적 스트레스를 최소화하기 위해서는 노출된 신경을 최대한 부드럽게 들어 올려야 하며, 핀셋형 전극은 접촉하지 않고 신경 가까이에 배치해야 합니다. 또한 너무 강한 전기 펄스는 바람직하지 않은 큰 다리 움직임을 유발하여 기계적 스트레스를 유발하거나 신경을 태울 수 있습니다. 신경에 심각한 손상이 관찰되면 전기 펄스 강도를 줄이거나 전극을 신경에서 더 멀리 배치하는 것이 좋습니다.
현재 프로토콜에서는 CAG 프로모터 구동 플라스미드를 발현 벡터로 사용했습니다. CAG 프로모터 구동 플라스미드는 생체 내에서 수초성 SC에서 높은 수준의 유전자 발현을 허용합니다. 우리는 또한 포유류 유전자 발현에 널리 사용되는 또 다른 보편적인 프로모터인 CMV 프로모터를 시도했지만 유전자 산물의 발현은 매우 약했습니다. 이것은 배아 뇌에서 전기천공 매개 형질감염이 수행된 이전 결과와 일치합니다20. 따라서 생체 내 전기천공 방법에 CAG 프로모터 구동 플라스미드를 사용하는 것이 좋습니다.
축삭 신호 전달은 수초화/탈수초화의 핵심 요소이기 때문에21, 뉴런의 유전자 변형도 중요합니다. 그러나 생 체 내 전기천공 방법을 사용한 이식 유전자의 전달은 SC로 제한됩니다. 성체 쥐의 후근 신경절(DRG) 뉴런에 생 체 내 전기천공을 적용할 때 좌골 신경 축삭으로의 유전자 전달이 달성될 수 있다고 보고되었습니다22. 이것은 세포체로의 플라스미드 DNA의 전달이 말초 축삭의 생체 내 형질감염에 중요할 가능성이 있음을 시사합니다. 따라서 수초화/탈수초화에서 축삭 분자의 관여를 조사하기 위해 연구자들은 유전자 변형 동물, 뉴런 특이적 바이러스 벡터 또는 DRG 뉴런에 대한 생체 내 전기천공과 같은 뉴런 특이적 유전 방법을 사용해야 합니다.
유전자 변형 동물계통(23 )의 생성 및 바이러스 벡터(4-6)에 의한 형질전환 유전자의 전달과 같은 현재의 방법과 비교하여, 생체 내 전기천공에 의한 SC의 유전자 변형은 더 간단하다. 이 방법은 플라스미드 DNA 구축에 며칠, 전기천공 수술에 하루만 필요합니다. 플라스미드 DNA 구축에는 일반적으로 바이러스 벡터 처리에 필수적인 생물학적 위험실이 필요하지 않습니다. 또한, 전기천공법의 장점 중 하나는 간단한 프로토콜을 사용하여 여러 유전자 산물을 동시에 발현할 수 있다는 것입니다. 우리의 새로운 기술은 수초화 및 탈수초화에 관여하는 다양한 신호 분자의 상호 작용을 분석하는 데 유용할 것입니다. 특히, 여러 가지 다른 세포내 형광 프로브의 공동 형질감염을 허용함으로써 우리의 방법은 라이브 이미징 실험을 사용하여 SC에서 세포내 신호 전달 역학을 조사하기 위한 강력한 도구가 되어야 합니다.

말초 신경계에서 감각 및 운동 정보의 빠른 전달은 슈반 세포(SC)1를 수초화하여 형성되는 미엘린 수초에 의해 허용됩니다. 미엘린 수초(myelin sheath)에 의한 축삭돌기의 절연은 염분 전도를 가능하게 하여 신경 자극의 속도를 증가시킵니다. 수초(myelin sheath)의 발달 또는 유지가 손상된 장애에서는 신경 전도 속도가 감소합니다. 이로 인해 운동 및 감각 기능 장애와 관련된 신경병증이 발생합니다. 말초 신경계에서 수초화(myelination)와 탈수초화(demyelination)의 분자 메커니즘에 대한 많은 연구가 있지만, 이러한 과정에 관여하는 수많은 단백질의 역할은 불분명합니다.
생체 내에서 SC 수초화/탈수초화의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 유전적 접근 방식을 사용하여 동물의 유전자 발현을 수정했습니다. 강력한 접근 방식은 녹아웃/넉인 또는 형질전환 동물을 사용하는 것입니다. 그러나 이러한 동물의 세대는 비용과 시간이 많이 듭니다. SC 특이적 유전자 조작을 위해서는 플록스된 균주와 Cre 마우스 또는 기타 조건부 유전자 발현 방법을 교차하는 것이 필요합니다. 이것은 다시 힘들고 시간이 많이 걸립니다. 최근 몇 년 동안 최첨단 유전 기술인 CRISPR-Cas9 시스템으로 인해 유전자 변형 마우스의 생성 속도가 훨씬 빨라졌지만(약 4주) 2,3 이 방법은 표적 염기서열 제한으로 인해 방해를 받고 있으며 off-target effect가 있습니다. 대안적인 방법으로, 바이러스 벡터 매개 유전자 전달은 in vivo4-6에서 SC로 유전자 전달을 달성하는 더 빠르고 쉬운 방법입니다. 실제로, 바이러스 벡터의 생성은 비용이 적게 들고 시간이 더 짧으며(몇 주 이내), 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터와 같은 엔지니어링된 바이러스 벡터를 좌골 신경에 주입하기만 하면 SC의 유전자 조작을 달성할 수 있습니다. 이러한 바이러스 벡터는 특성이 다르기 때문에 사용자는 자신의 목적에 가장 적합한 벡터를 선택해야 합니다. 아데노바이러스 벡터는 어린 좌골 신경과 성숙한 좌골 신경 모두에서 축삭돌기와 SC를 감염시킵니다. 특히, 아데노바이러스 벡터는 수초성 SC보다 비수초성 SC에 대해 선택적으로 더 높다. 아데노바이러스는 면역 반응을 유발할 수 있으므로 면역결핍 균주를 사용해야 한다5. AAV 벡터는 현재 가장 널리 사용되는 바이러스 벡터이며, 독성이 낮은 in vivo 유전자 전달이 가능합니다7. AAV는 신경 섬유에 직접 주입하여 축삭과 SC를 모두 형질전환 할 수 있습니다8,9. 그러나 AAV 매개 단백질 발현은 일반적으로 최대 수준7,9에 도달하는 데 3주 이상이 필요합니다. 따라서 산후 2주일 동안 활발하게 진행되는 수초화를 분석하기는 어렵습니다. 렌티바이러스 벡터는 비수초성 SC보다 수초성 SC에 대해 선택적으로 더 높으며 좌골 신경에 독성 영향을 미치지 않습니다. 그러나 렌티바이러스 벡터는 더 성숙한 신경5에서 SC를 감염시키지 않으므로 탈수초 과정과 같은 이벤트를 분석하는 데 적합하지 않습니다.
Electroporation는 생체 내 유전자 전달을 달성하는 또 다른 더 빠르고 쉬운 접근 방식입니다. SCs의 in vivo transfection은 transection된 쥐 좌골 신경에 electroporation이 적용될 때 달성될 수 있다고 보고되었다10. 그러나 이 방법은 유전자 전달을 위해 신경 절개가 필요하기 때문에 응용 프로그램은 손상된 신경을 분석하는 데 국한됩니다. 여기에서는 electroporation11을 사용하여 온전한 쥐 좌골 신경에서 수초성 SC로 전이유전자를 전달할 수 있는 대체 방법을 설명합니다. 이 방법은 플라스미드 구축이 필요하며, 일반적으로 일주일 이내에 완료할 수 있습니다. 그런 다음, 플라스미드 DNA가 주입된 좌골 신경의 부위에 전기 펄스를 전달하기만 하면 신생아 및 더 성숙한 동물에서 수초성 SC의 매우 선택적인 형질주입이 달성될 수 있습니다. 여러 플라스미드를 전기천공화함으로써 다양한 유전자의 동시 발현을 쉽게 달성할 수 있습니다. 신호 단백질, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 기능성 프로브와 같은 여러 분자를 동시에 발현하는 능력은 수초화 및 탈수초화와 같은 복잡한 과정을 조사하는 데 매우 중요합니다. 이 논문에 설명된 새로운 생체 내 전기천공법은 연구자들이 다수의 분자의 기능과 수초화 SC에서 상호 작용을 분석할 수 있는 강력한 도구가 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Genopure 플라스미드 맥시 키트</td><td>Roche</td><td>03 143 422 001</td><td>플라스미드 DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>패스트 그린 CFC</td><td>WAKO</td><td>069-00032</td><td>DNA 주입 용 염료</td></tr><tr><td>GC 150T-10</td><td>HARVARD APPARATUS</td><td>30-0062</td><td>유리 모세관</td></tr><tr><td>흡입 튜브</td><td>Drummond</td><td>05-2000-00</td><td>마이크로 주입 용 흡입 튜브</td></tr><tr><td>MODEL P-97</td><td>SUTTER INSTRUMENT 공동.</td><td>마이크로 피펫 풀러</td><td></td></tr><tr><td>CUY21 단일 셀</td><td>BEX</td><td>Electroporator CUY21 단일 셀</td><td>펄스 발생기</td></tr><tr><td>전기 워머</td><td>KODEN</td><td>CAH-6A</td><td>수술 중 워머</td></tr><tr><td>이소 플루올란</td><td>마일란</td><td>1119701G1076</td><td>마취</td></tr></tbody></table>제

electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

슈반 세포(SC)에 의한 수초의 형성은 말초 신경계의 축삭을 따라 신경 자극의 빠른 전도에 필수적입니다. 살아있는 동물에서 SC 선택적 유전자 조작은 생체 내에서 SC 수초화 및 탈수초화의 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. knockout/knockin 및 형질전환 마우스는 SC 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구이지만 이러한 방법은 비용과 시간이 많이 소요됩니다. 바이러스 벡터 매개 이식유전자를 좌골 신경에 도입하는 것은 더 간단하고 덜 힘든 방법입니다. 그러나 바이러스 방법은 독성, 전이유전자 크기 제약, 특정 발달 단계로 제한되는 감염성과 같은 한계가 있습니다. 여기에서는 전기천공법을 사용하여 설치류 좌골 신경에서 수초성 SC의 선택적 형질 주입을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 플라스미드 DNA 주입 부위의 좌골 신경에 전기 펄스를 적용함으로써, 관심 유전자는 신생아 및 더 성숙한 동물 모두에서 SC에서 쉽게 침묵되거나 과발현될 수 있습니다. 또한, 이러한 in vivo electroporation 방법은 여러 transgenes의 매우 효율적인 동시 발현을 가능하게 합니다. 우리의 새로운 기술을 통해 연구자들은 SC 유전자 발현을 효율적으로 조작하고 SC 발달 및 기능에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다.

플라스미드 발현 적색 형광 단백질 (RFP)로 형질 좌골 신경의 예는도 2a에 도시된다. 양극성 형태를 나타내는 세포의 특성으로 SC는, 띄엄 띄엄 RFP로 형질 감염시켰다. 어떤 RFP 형광은 축삭에서 검출되지 않았다. 우리는 일반적으로 ~ 모든 신경 100 형질으로 SC를 찾을 수 있습니다. 이 형질 전환 효율은 렌티 바이러스 벡터 (4)를 이용하여 생체 내 SC 감염 효율과 유사한 것으로 보인다. 면역 염색 실험은 보여 주었다 대부분 (~ 96 %) P7의 S100하는 SC 마커 (그림 2B)에 대한 공동 표지 및 P14의에서 RFP 양성 세포의 91 % MBP에 대한 공동 표시하는 myelinating의 SC 마커에서 RFP 양성 세포 (도 2c)은, 전기 천공에 의한 유전자 이동을 시사 SC와 myelinating에 매우 선택적이다. 희주에 여러 유전자의 소개 <e생체 내에서 m은&gt; 수초 / 탈수 초화의 메커니즘을 조사하기위한 매우 유용 할 것이다. 여기에 설명 된 생체 전기 천공 방법의 주요 장점은 간단한 방법으로 여러 유전자를 전달하는 능력이다. 도 2D는 생체 전기에 사용 GFP 및 RFP 발현 플라스미드의 혼합물로 형질 좌골 신경의 대표적인 이미지를 나타낸다. 희주의 약 97 %는 다수 유전자의 효율적인 전달이 단순히 여러 플라스미드 혼합물 electroporating함으로써 달성 될 수 있음을 시사 GFP RFP 이중 양성이었다. 설치류, 수초 극적 출생 처음 두 주 동안 증가 출생 주위 개시 후 서서히 감소한다. 따라서, 유전이 개발 시간 창 동안 희주를 조작하여, 수초의 서로 다른 단계의 기초가되는 메커니즘을 명확히 할 수있다. 렌티 바이러스 벡터는을위한 좋은 도구입니다그들은 최소한의 독성이 특히로서, 수초를 nalyzing하지만, 렌티 바이러스는 신생아 좌골 신경 5,6 감염. 형질이 (그림 2E, 아래) P3 (그림 2E, 상단) 또는 P14 실시 할 때 비교, 전기 매개 유전자 전달이 잘 작동합니다. 생체 전기 방식에서 소설의 응용 프로그램은 여기에 설명되어 있습니다. 그림 3a는 GFP 발현 다양한 발달 단계 (P7, P14, P21 및 P31)에서 myelinating SC와의 광학 현미경 이미지를 보여줍니다. 광학 현미경 분석에 의해, 같은 길이와 직경 등의 형태 학적 매개 변수의 변화, 평가 될 수있다. 이러한 매개 변수 일렉트릭 신경이 상당한 손상 효과없이 개발할 것을 제안, 그대로 쥐의 말초 신경 (15, 16)에 비해 비슷한 값을 가질 수 있습니다. 그림 3b는 LacZ를-expre의 전자 현미경 이미지를 보여줍니다ssing으로 SC를 myelinating. 이 경우는 LacZ를 발현 마커로서 사용 하였다. β - 갈 락토시다 bluo 갤런, 에탄올 불용 기판을 사용하여 염색 전자 현미경 (11, 17)에 의해 형질으로 SC의 미엘린 구조의 분석을 가능하게한다. 이 실험에서, 신호 분자의 역할을하여 손실 함수 또는 기능 획득 효과의 분석을 허용 침묵 또는 발현 증강에 의해 검사 될 수있다. 고정 된 조직의 분석뿐만 아니라, 생체 내 전기 천공 - 매개 된 유전자 전달은 이미징 실험 생활에 적용될 수있다. 예를 들어, 그림 3c는 G-GECO1.1 (18), 녹색 형광 세포질 칼슘 2 + 표시하고, R-GECO1mt (19), 적색 형광 미토콘드리아 칼슘 2 + 표시를 공동으로 표현하는 myelinating의 SC를 보여줍니다. 이러한 지표를 표현함으로써, 우리는 희주를 myelinating에서 세포질과 미토콘드리아 칼슘 농도를 제어하는 신호 전달 경로를 확인<html> . 따라서, 본 방법은 유전 학적으로 인코딩 된 형광 프로브는 관심있는 신호를 검출 할 수있는 경우, 특히, 신호 전달 메커니즘의 다양성을 연구하기 위해 이용 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig1.jpg" /> 그림 1 :. 제 i n은 생체 내의 Electroporation 방법 첫째, 마취 된 쥐의 좌골 신경의 도식이 노출된다. 둘째, 플라스미드 DNA는 좌골 신경으로 주입된다. 셋째, 전기 펄스는 집게 형상 전극을 주사 부위로 전달된다. 마지막으로, 상처 접착제로 폐쇄된다. 이 절차는 반대측 신경에 반복 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig2.jpg" /> 그림 2 : 감염된 좌골 신경에 대표 결과 (A)가 형질 전환 된 좌골 신경의 대표 이미지.. 신경은 P3에서 RFP 발현 플라스미드로 형질 및 P7에서 수정되었습니다. (B) S100하는 SC 마커와 colocalization을을 보여주는 P7에서 RFP 형질 세포의 대표 이미지입니다. MBP하는 myelinating 사우스 캐롤라이나 마커 colocalization을을 보여주는 P14에서 RFP 형질 좌골 신경의 (C) 대표 이미지입니다. (D) GFP 및 RFP 발현 플라스미드와 동시 형질 감염된 좌골 신경의 대표 이미지입니다. 형질 SCS는 동시에 GFP 및 RFP를 표명했다. (E) 수초가 시작 P3, (위)에 형질 전환 P31에서 희주를 myelinating의 이미지와 가장 큰 축삭이 (아래) 유수 될 P14에서 P31 형질에서 myelinating 희주의 이미지, 그 TRANSF 제안myelinating의 희주의 ection 신생아 신경에서뿐만 아니라, 더 성숙한 신경에서뿐만 아니라 달성 될 수있다. 스케일 바 = 200 μm의 (A); 50 μm의 (BE). 이 그림은 이전 간행물 (11) 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig3.jpg" /> 그림 3 :. 생체 내 Electroporation에 (A)으로 SC를 myelinating의 개발의 빛 현미경 분석의 응용 프로그램. 좌골 신경은 P3에서 GFP 발현 플라스미드로 전기 천공하고, 다양한 발달 단계 (P7, P14, P21 및 P31)에 고정되었다. GFP 양성 희주의 대표 이미지는 왼쪽에 표시됩니다. 평균 길이와 직경 (N = 3 SEM ± 평균으로 요약0 - 오른쪽에 3 신경) 47. 개발이 진행됨에 따라 희주의​​ 증가를 myelinating의 길이와 직경. (B) 플라스미드 부호화 LacZ를 형질 좌골 신경의 전자 현미경 이미지. 형질 감염된 SC (좌측 화이트 별표) 미세 β - 갈 락토시다 아제 반응 생성물의 침전물로 표지 하였다. (C) G-GECO1.1, 녹색 형광 세포질 칼슘 2 + 표시하고, R-GECO1mt, 적색 형광 미토콘드리아 칼슘 2 + 표시와 함께 동시 형질 감염된 사우스 캐롤라이나의 이미지입니다. 흰색 점선 사각형 내의 영역은 오른쪽 패널에 확대 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm의 (A 및 C); 1 ㎛ (B). 이 그림은 이전 간행물 (11) 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 설치류 좌골 신경의 슈반 세포(SC)로 유전자를 전달하는 생체 내 기술을 제시합니다. 이 간단한 기술은 수초성 SC의 발달 및 유지와 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

이 새로운 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 전기천공법을 이용하여 설치류 좌골 신경의 슈반 세포에 효율적으로 생체 내 유전자 전달을 수행하는 것입니다. 이 방법은 말초 신경계의 수초화 및 탈수초화의 분자적 기전과 같이 신경과학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 외과 의사가 간단한 절차를 통해 슈반 세포에 생체 내 형질전환을 수행할 수 있다는 점입니다.절차를 시작하기 위해, 모든 수술 기구와 0.9% sodium chloride 용액을 오토클레이브로 멸균합니다. 다음으로, 피펫 풀러를 사용하여 유리 피펫을 당겨 뽑은 후, 각 피펫의 팁 끝을 30에서 50 microns 직경으로 절단합니다. 유도 상자에서 이소플루란으로 쥐 새끼를 마취시킨 후, 실체 현미경 아래의 예열된 전기 워머 위에 쥐를 배치합니다.발가락 꼬집기(toe pinching)를 통해 마취 상태가 적절한지 확인합니다. 그 다음, 수술 중 안구 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 페이스 마스크를 통해 isoflurane을 지속적으로 투여하여 마취 상태를 유지합니다.다음으로, 수술용 테이프로 동물의 다리를 고정하고 포비돈 요오드로 뒷다리 허벅지 피부를 세척합니다. 메스로 절개합니다. 두 개의 바늘을 사용하여 대퇴사두근과 대퇴이두근 사이에 틈을 만들어 좌골신경을 노출시킵니다.그 다음, 신경에 0.9% sodium chloride 용액을 도포하고, 보풀 없는 종이로 과잉 수분을 흡수합니다. 이후 유리 마이크로피펫의 하단부를 유연한 튜브에 삽입합니다. 흡입을 통해 마이크로피펫에 적당량의 DNA 용액을 천천히 채웁니다.이제 바늘을 사용하여 신경의 원위부를 부드럽게 당겨 노출된 신경을 들어 올립니다. 유리 마이크로피펫을 신경의 원위부 지점에 삽입하고, 신경이 초록색으로 보일 때까지 약간의 양압을 가하여 DNA 용액을 주입합니다. 다음으로, 핀셋 형태의 백금 전극을 신경에서 약 1~2mm 떨어진 곳에 배치합니다.전극과 신경 사이의 간격을 0.9% sodium chloride 용액으로 채웁니다. electroporator를 사용하여 주입 부위에 전기 펄스를 가합니다. 첫 번째 펄스 세트가 끝난 후, 전극을 반대로 뒤집어 다른 펄스 세트를 가합니다.그 후, 전기천공 부위를 0.9% sodium chloride 용액으로 세척하고 반대쪽 좌골신경에 동일한 절차를 반복합니다. 전기천공이 끝나면 시아노아크릴레이트 접착제로 절개 부위를 폐쇄합니다. 그런 다음 포비돈 요오드로 상처 부위를 세척합니다.동물로부터 페이스 마스크를 제거하고, 마취에서 완전히 회복될 수 있도록 최소 1시간 동안 전기 가온기에 둡니다. 이후, 새끼 쥐를 어미 쥐에게 돌려보냅니다. 필요한 경우 비스테로이드성 항염증제인 carprofen 또는 오피오이드성 진통제인 buprenorphine을 투여합니다.여기에 형질전환된 좌골 신경의 대표 이미지가 제시되어 있습니다. 신경은 P3 단계에서 RFP 발현 플라스미드로 형질전환되었으며, P7 단계에서 고정되었습니다. 이것은 P7 단계에서 RFP가 형질전환된 세포의 대표 이미지로, 슈반 세포 마커인 S100과의 공국소화(colocalization)를 보여줍니다. 그리고 이것은 P14 단계에서 RFP가 형질전환된 좌골 신경의 대표 이미지로, 수초화 슈반 세포 마커인 MBP와의 공국소화(colocalization)를 보여줍니다.GFP 및 RFP 발현 플라스미드가 공동 형질전환된 좌골신경의 대표 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 형질전환된 슈반 세포(Schwann cell)는 GFP와 RFP를 동시에 발현했습니다. 이 그림은 수초화가 시작되는 P3에 형질전환되어 P31에 관찰한 수초화 슈반 세포의 이미지와, 대부분의 대형 축삭이 수초화되는 P14에 형질전환되어 P31에 관찰한 수초화 슈반 세포의 이미지를 보여줍니다.이 이미지들은 수초화된 슈반 세포(myelinating Schwann cells)의 형질전환이 신생아 신경뿐만 아니라 더 성숙한 신경에서도 가능하다는 것을 시사합니다. 이 영상을 시청하고 나면 좌골 신경에 전기천공법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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출처: Ino, D. et. al., 전기천공에 의한 설치류 좌골 신경의 슈완 세포로의 생체 내 유전자 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 전기천공법을 사용하여 설치류 좌골 신경의 슈완 세포로의 생체 내 유전자 전달을 보여줍니다. 플라스미드 DNA-염료 용액이 신경에 주입되고 전기 펄스가 DNA 진입을 용이하게 합니다. DNA는 나중에 세포의 게놈에 통합되어 슈완 세포에서 성공적인 유전자 전달을 가능하게 합니다.

전기천공을 통한 설치류 좌골 신경의 슈완 세포로의 유전자 전달

출처: Li, Q. et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 축삭 재생을 연구하기 위해 마우스 DRG 뉴런의 전기천공 매개 형질감염을 보여줍니다. DRG 뉴런에 핵산 구조물을 전달하고, 좌골 신경 손상을 유도하고, 축삭 재생을 평가하는 단계를 간략하게 설명합니다.

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PVDF TrFE 도관 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 하 Transected 쥐 척수 젊고 아름 다운 여자를 다리 안에 이식 Schwann 세포

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성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

배우세요 쥐 좌골 신경의 슈반 세포에 전기천공법을 이용한 생체 내 유전자 전달 방법을. 말초신경계의 미엘린화 및 탈미엘린화 분자 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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