Name: Analyse des SCAP N -glycosylation Et la traite des cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée pour analyser la N-glycosylation de SCAP et son trafic dans les cellules humaines U87. Cette approche par western blot et microscopie confocale facilite l'étude du métabolisme lipidique et des maladies métaboliques.

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Nous sommes reconnaissants aux Drs Mike S. Brown et Joseph L. Goldstein d’avoir accepté de publier cette méthode selon les méthodes décrites dans leurs publications. Nous remercions le Dr Peter Espenshade d’avoir partagé le plasmide GFP-SCAP. Ce travail a été soutenu par les subventions NS072838 et NS079701 des NIH à D.G., la subvention de recherche RSG-14-228-01-CSM de l’American Cancer Society à D.G., et la bourse postdoctorale OSUCCC Pelotonia à C.C. Nous apprécions également le soutien de l’Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) et du programme thérapeutique translationnel de l’OSUCCC pour la subvention de démarrage et les fonds de démarrage de D.G.

1. Détection de Endogène SCAP protéine dans les cellules humaines <ol><li> Culture cellulaire et traitement <ol><li> Cellules de graine ~ 1 × 10 6 U87 dans une boîte de 10 cm avec du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS) et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures avant le traitement. </li><li> Laver les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (PBS), puis passer les cellules dans un milieu de DMEM frais avec ou sans glucose (5 mM) pendant 12 heures. </li></ol></li><li> Préparation de la membrane cellulaire Fractions et nucléaires Extraits <ol><li> Laver les cellules une fois avec du PBS, grattent dans 1 ml de PBS, et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans un tampon glacé contenant 10 mM de HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, l&#39; acide éthylènediaminetétracétique de sodium 1 mM (EDTA), 1 mM d&#39; acide éthylène de sodium glycol tétraacétique (EGTA), 250 mM le saccharose et un mélange d&#39;inhibiteurs de protéase (5 μg / ml de pepstatine A, 10 ug / ml de leupeptine mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,5 (PMSF), 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 25 pg / ml de N-acétyl-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) pendant 30 min sur la glace. </li><li> Passer les extraits cellulaires à travers un 22 G x 1 1/2 aiguille 30 fois et centrifuger à 890 x g à 4 ° C pendant 5 minutes pour isoler les noyaux. </li><li> Utiliser le surnageant pour la séparation des fractions de membrane (étape 1.2.7). Remettre en suspension le culot nucléaire dans 0,1 ml de tampon C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M de NaCl, 2,5% (v / v) de glycerol, 1,5 mM de MgCl2, EDTA de sodium et 1 mM, EGTA de sodium à 1 mM , et un mélange de les inhibiteurs de la protéase (5 ug / ml de pepstatine A, 10 ug / ml de leupeptine, 0,5 mM de PMSF, 1 mM de DTT et 25 pg / ml ALLN)). </li><li> Tourner la suspension à 4 ° C pendant 60 min et centrifuger à 20 000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 20 min à 4 ° C. Le surnageant est désigné comme «extraits nucléaires». </li><li> Chauffer les extraits nucléaires à 100 ° C pendant 10 min avec un tampon 5x de chargement (312,5 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glycerol, 12,5% de β-mercaptoéthanol et 0,05% de bleu de bromophénol) avant de le soumettre à une SDS-PAGE. </li><li> Centrifuger le surnageant de la rotation initiale de 890 g à 20 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Pour l&#39;analyse Western Blot subséquente, on dissout le culot dans 0,1 ml de tampon SDS de lyse (Tris-HCl 10 mM pH 6,8, 100 mM de NaCl, 1% (v / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS), de l&#39;EDTA de sodium 1 mM, et 1 mM EGTA de sodium). Ceci est appelé «fraction membranaire». NOTE: Nous utilisons 20 000 xg pendant 20 minutes pour sédimenter les membranes. 100 000 g pendant 10 - 20 min a été utilisé dans les études de laboratoire Brown et Goldstein 15. </li><li> Incuber la fraction membranaire à 37 ° C pendant 30 minutes et on détermine la concentration en protéine par dosage de protéine de Bradford. Ajouter une solution de bleu de bromophénol 100x 1 pi avant de soumettre les échantillons à SDS-PAGE. </li><li> Charge 25 - 50 pg de protéines membranaires totales sur un gel SDS-PAGE à 10% 39. Exécutez le gelà 80 V pendant 15 min, puis changer à 130 V et courir pour un autre 115 min. Transfert à 140 mA pour 130 min 39. <ol><li> Pour l&#39;analyse Western blot, utiliser un anticorps anti-SCAP pour détecter la protéine SCAP totale. Utiliser une protéine disulfure isomérase (PDI), une protéine ER-résidente 40, en tant que contrôle interne. Utiliser l&#39;anti-SREBP-1 pour détecter des anticorps du groupe N-terminal de SREBP-1. Utilisez Lamin A comme contrôle interne pour les extraits nucléaires 31. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Analyse des SCAP N -glycosylation dans les cellules humaines <ol><li> Culture cellulaire, Transfection et traitement <ol><li> Pour l&#39; analyse de la membrane, les cellules des semences ~ 1 × 10 6 HEK293T dans un plat de 10 cm avec du DMEM supplémenté avec 5% de SBF et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures avant la transfection. </li><li> Diluer 4-8 pg GFP-SCAP plasmide (un don du Dr. Peter Espenshade) 22 dans 1 ml réduits milieu sérique et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 8-16 ul réactif ADN de transfection par pipetage directement dans les 1 ml réduction moyenne de sérum contenant des plasmides et mélanger doucement. </li><li> Incuber le complexe réactif / plasmide de transfection pendant 25 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter complexe de transfection des cellules avec un milieu frais et continuer à la culture pendant 24 heures à 5% de CO 2 et 37 ° C. </li><li> Laver une fois avec du PBS et traiter les cellules pendant 12 heures avec ou sans glucose (5 mM) en présence ou en l&#39; absence de tunicamycine (1 pg / ml), un inhibiteur de N -glycosylation. </li></ol></li><li> Préparer des pastilles de la membrane cellulaire, comme décrit dans les étapes 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, et 1.2.7. </li><li> Détection de SCAP N -glycosylation <ol><li> trypsine protéolyse <ol><li> Remettre en suspension les culots de membranes à partir de cellules surexprimant GFP-SCAP dans 114 ul d&#39; un tampon contenant du HEPES 10 mM de KOH (pH 7,4), KCl 10 mM , MgCl2, EDTA de sodium et 1,5 à 1 mM et NaCl 100 mM. </li><li> Incuber 5781; l des aliquotes de protéines de la membrane en l&#39;absence ou en présence de 1 pi de trypsine (1 ug / ul) dans un volume total de 58 ul, pendant 30 min à 30 ° C. </li><li> Arrêter les réactions par l&#39;addition de 2 ul (400 unités) d&#39;inhibiteur de trypsine de soja. </li></ol></li><li> La déglycosylation de la N- glycosidase F de peptides (PNGase F) <ol><li> Pour un traitement ultérieur avec de la PNGase F, ajouter 10 pl de solution contenant 3,5% (poids / volume) de SDS et 7% (vol / vol), 2-mercaptoéthanol à chaque échantillon. </li><li> Après chauffage à 100 ° C pendant 10 min, ajouter séquentiellement 7 ul de phosphate de sodium 0,5 M (pH 7,5), 7 ul de 10% (v / v) Nonidet P-40 avec des inhibiteurs de 12 x de la protéase, et 2 ul (0,5 U / ul) de PNGase F. </li><li> Après incubation à 37 ° C pendant 3 h, stopper les réactions par l&#39;addition d&#39;un tampon 5x de chargement (Tris-HCl 312,5 mM, pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glycerol, 12,5% de β-mercaptoéthanol et 0,05% de bleu de bromophénol). Chauffer le mélange à 100 ° C pendant 10 met soumis à une SDS-PAGE. Charge de 25 à 50 pg de protéines membranaires totales sur un gel SDS-PAGE à 10% 39. Exécutez le gel à 80 V pendant 15 min, puis changer à 130 V pour une autre 115 min. Transfert à 140 mA pour 130 min. </li><li> Pour le transfert de Western, en utilisant 10 pg / ml d&#39; anticorps anti-PAP (9D5) afin de détecter la protéine N et -glycosylation SCAP totale. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Détection de SCAP traite de ER à l&#39;Golgi à l&#39;aide de la GFP-SCAP dans les cellules humaines <ol><li> Semences de 2,5 x 10 5 cellules U87 dans une boîte de 60 mm avec du DMEM supplémenté avec 5% de SBF et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 heures avant la transfection. </li><li> Diluer 4 pg GFP-SCAP plasmide dans 0,5 ml réduite de milieu sérique et mélanger. </li><li> Ajouter 8 ul réactif ADN de transfection par pipetage directement dans 0,5 ml de milieu sérique réduit contenant des plasmides et mélanger doucement. </li><li> Incuber le complexe réactif / plasmide de transfection pendant 25 minutes à la chambretempérature. </li><li> Ajouter complexe de transfection des cellules avec un milieu frais et continuer à la culture pendant 24 heures à 5% de CO 2 et 37 ° C. </li><li> Réensemencer 5 - 10 × 10 4 cellules dans une plaque de 6 puits contenant une lamelle de verre (22 mm x 22 mm) et continuer à la culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures. </li><li> Laver une fois avec du PBS et traiter les cellules pendant 12 heures avec ou sans glucose (5 mM) en présence ou en l&#39;absence de tunicamycine (1 pg / ml). </li><li> Laver les cellules une fois avec du PBS et fixer dans 4% de formaldéhyde pendant 10 min. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS, inverser les lamelles, monter sur des lames avec antifade réactif, et sceller les lamelles à l&#39;aide de vernis à ongles. </li><li> Vérifiez le trafic GFP-SCAP en utilisant un objectif à immersion d&#39;huile 63X dans un balayage laser confocal microscope 41. </li></ol>

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<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+Makes+Fat+by+Talking+to+SCAP%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sugar Makes Fat by Talking to SCAP.</a> Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+through+an+Akt-SREBP-1-dependent%2C+rapamycin-resistant+pathway+sensitizes+glioblastomas+to+antilipogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy.</a> Sci Signal. 2, 82(2009).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR+agonist+promotes+GBM+cell+death+through+inhibition+of+an+EGFR%2FAKT%2FSREBP-1%2FLDLR-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway.</a> Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).</li>
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<li>Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+extracellular+signaling+utilizing+a+glycoproteomic+approach%3A+lectin+blot+surveys%2C+a+first+and+important+step%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step.</a> Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour l&#39;isolement des fractions membranaires des cellules humaines et pour la préparation des échantillons pour la détection de SCAP N -glycosylation et la protéine totale en utilisant Western Blot. Nous fournissons en outre un procédé pour surveiller le trafic de SCAP en utilisant GFP-étiquetage et la microscopie confocale. La méthode est spécifiquement utilisé pour analyser la protéine de la membrane et est un outil important pour étudier SCAP N -glyco...

La dérégulation du métabolisme des lipides est une caractéristique commune des maladies cancéreuses et métaboliques 1-6. Dans ces procédés, les protéines de régulation du stérol élément de liaison (SREBPs), une famille de facteurs de transcription, jouent un rôle crucial dans le contrôle de l&#39;expression des gènes importants pour l&#39;absorption et la synthèse du cholestérol, des acides gras et des phospholipides 7-10. SREBPs, y compris SREBP-1a, SREBP-1c, et SREBP-2, sont synthétisés sous forme de précurseurs inactifs qui se lient à la membrane du réticulum endoplasmique (RE) en vertu de deux domaines transmembranaires 7. L&#39; extrémité N-terminale de SREBPs contient un domaine de liaison d&#39;ADN pour la transactivation des gènes cibles 11. L&#39;extrémité C-terminale des précurseurs de SREBP se lie à SREBP clivage protéine d&#39; activation (SCAP) 12,13, une protéine membranaire polytopic qui joue un rôle central dans la régulation de la stabilité et de l&#39; activation 14-16 SREBP. La mise enla mise en fonction de la transcription nécessite la translocation du complexe SCAP / SREBP du RE à l&#39;appareil de Golgi, où deux proteases clivent séquentiellement SREBP et la libération de son fragment N-terminal, qui pénètre alors dans le noyau pour la transactivation des gènes lipogenèse 7. Dans ces procédés, les niveaux de stérols dans la membrane du RE contrôlent la sortie du complexe SCAP / SREBP du RE 7,17. Dans des conditions de stérol élevées stérol se lie à SCAP ou ER-résident insuline induite par la protéine du gène-1 (Insig-1) ou 2 (Insig-2), l&#39;amélioration de l&#39;association des SCAP avec Insigs qui maintiennent le complexe SCAP / SREBP dans le ER 18-20. Lorsque les niveaux de stérols diminuent, SCAP dissocie avec Insigs. Cela conduit à un changement conformationnel SCAP, ce qui permet une interaction avec SCAP protéines d&#39;enveloppe communes complexe (COP) II. Le complexe médie l&#39;incorporation du complexe SCAP / SREBP dans les vésicules en herbe et dirige son transport de l&#39;ER au Golgi 21,22. Sur TransLocation du Golgi, SREBPs sont séquentiellement clivés par Site-1 et Site-2 protéases, conduisant à la libération de l&#39;extrémité N-terminale 7,23-29. Protéines SCAP porte trois N oligosaccharides liés en au asparagine (N) positionne N263, N590, N641 et 15. Nous avons récemment révélé que le glucose médiée N -glycosylation de SCAP dans ces sites est une condition préalable à SCAP / SREBP traite de l&#39;ER au Golgi dans des conditions de stérol bas 30-32. Perte de SCAP glycosylation par mutation de tous les trois asparagine en glutamine (NNN à QQQ) désactive le trafic de / complexe et les résultats de SREBP SCAP dans l&#39;instabilité de la protéine et de la réduction de l&#39; activation de SREBP 31 SCAP. Nos données récentes démontrent également que SREBP-1 est fortement activée dans le glioblastome et réglementé par SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Ciblage SCAP / SREBP-1 signalisation est en train de devenir une nouvelle stratégie pour traiter les tumeurs malignes et métaboliques syndromes 1,3,35-38. Par conséquent, il est important de développer une méthode efficace pour analyser les niveaux de protéines SCAP et N -glycosylation et de surveiller son trafic de cellules et de tissus humains de patients. La région luminale des protéines SCAP (acides aminés 540-707) dans le ER contient deux sites de -glycosylation N (N590 et N641) qui sont protégés de la protéolyse lorsque les membranes sont intactes sont traitées avec de la trypsine 15. Ce fragment a luminale a une masse moléculaire de ~ 30 kDa qui est suffisamment petite pour permettre la résolution des variants glycosylés individuels de SCAP par dodécylsulfate de sodium gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) 15,31. Ici, nous fournissons une méthode permettant de détecter la N -glycosylation de PAP et la protéine totale dans les cellules humaines. Ce protocole est dérivé du procédé décrit dans les publications du laboratoire Brown et Goldstein 15 et notre publication récente 31. Le protocole peut être utilisé en til étudie des protéines SCAP à partir de cellules de mammifères.

<table><tbody><tr><td>X-treme GENE HP DNA Réactif de transfection</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMI medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>trypsine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de la trypsine de soja</td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-SCAP (9D5) &nbsp ;</td><td>Anticorps Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>GFP&nbsp ;</td><td>Anticorps Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>SREBP-1 (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps PDI (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Lamin A (H-102)</td><td>Anticorps Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>SCAP (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s milieu (DMEM) sans glucose, pyruvate et glutamine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>Ajouter 1 mM de pyravate et 4 mM de glutamine avant utilisation</td></tr><tr><td>22 g x 1 1/2 aiguille</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>pepstatine A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>leupeptine</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Solution 0,5 M pH 8,5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0,5 M stérile (pH 8,0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bromophénol bleu</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>prolong gold réactif anti-décoloration avec dapi</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>pyruvate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des scap<em&gt; n</em&gt; -glycosylation et la traite des cellules humaines

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Une lipogenèse élevée est une caractéristique commune du cancer et des maladies métaboliques. Les protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBPs), une famille de facteurs de transcription liés à la membrane contrôlant l’expression de gènes importants pour la synthèse du cholestérol, des acides gras et des phospholipides, sont fréquemment régulées à la hausse dans ces maladies. Dans le processus de translocation nucléaire de SREBP, la protéine d’activation du clivage de SREBP (SCAP) joue un rôle central dans le trafic de SREBP du réticulum endoplasmique (RE) vers le Golgi et dans l’activation ultérieure de la protéolyse. Récemment, nous avons découvert que la N-glycosylation de SCAP médiée par le glucose est une condition préalable à la sortie de SCAP/SREBP du RE et au mouvement vers le Golgi. La N-glycosylation stabilise le SCAP et dirige le trafic SCAP/SREBP. Ici, nous décrivons un protocole pour l’isolement des fractions membranaires dans les cellules humaines et pour la préparation des échantillons pour la détection de la N-glycosylation SCAP et de la protéine totale à l’aide du western blot. Nous proposons en outre une méthode pour surveiller le trafic SCAP à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole est approprié pour l’étude de la N-glycosylation SCAP et du trafic dans les cellules de mammifères.

La figure 1 montre la détection d&#39; une protéine endogène et SCAP SREBP-1 sous forme nucléaire dans les cellules du glioblastome U87 humains en réponse à une stimulation de glucose en utilisant Western Blot. SCAP protéine membranaire est détectée dans la «fraction membranaire». La forme de noyau (N-terminal) de SREBP-1 est détectée dans les «extraits nucléaires». Le niveau de protéine SCAP (PDI sert de contrôle interne des protéines de la membrane ER) et SREBP-1...

Nous décrivons un procédé modifié pour l&#39; isolement de la fraction membranaire à partir de cellules humaines et la préparation des échantillons pour la détection de SCAP N -glycosylation et la protéine totale en utilisant Western Blot. Nous présentons en outre un procédé GFP-étiquetage pour surveiller le trafic SCAP utilisant la microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé dans les laboratoires de biologie réguliers.

Analyse des SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Et la traite des cellules humaines

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir une approche simple pour analyser la N-glycosylation de SCAP et son trafic dans les cellules humaines. Cette méthode permet d'analyser la N-glycosylation de SCAP, qui est indispensable au trafic de SCAP et à l'activation du métabolisme lipidique médié par SREBP dans les cellules de mammifères. Contrairement à la méthode classique utilisant des lectines, notre méthode offre une procédure simple pour identifier la N-glycosylation de SCAP, en détectant le décalage de migration après élimination du N-glycane à l'aide de PNGase.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cancer, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les maladies cardiovasculaires et les syndromes métaboliques. Pour commencer cette procédure, ensemencer un fois dix puissance six cellules U87 dans une boîte de 10 centimètres avec du DMEM supplémenté en 5 % de FBS, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures avant le traitement. Ensuite, laver les cellules une fois avec du PBS.Ensuite, remplacer le PBS par du milieu DMEM frais avec ou sans glucose pendant 12 heures. Pour préparer les fractions de

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Découvrez une méthode simplifiée pour analyser la N-glycosylation de SCAP et son trafic dans les cellules humaines U87. Cette approche par western blot et microscopie confocale facilite l'étude du métabolisme lipidique et des maladies métaboliques.

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