Name: Analyse von SCAP N -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Erfahren Sie eine vereinfachte Methode zur Analyse der SCAP N-Glykosylierung und des Traffickings in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung lipidmetabolischer Prozesse mittels Western Blot und konfokaler Mikroskopie.

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Wir danken Dr. Mike S. Brown und Dr. Joseph L. Goldstein für ihre Zustimmung, diese Methode gemäß den in ihren Publikationen beschriebenen Methoden zu veröffentlichen. Wir danken Dr. Peter Espenshade für das Teilen des GFP-SCAP-Plasmids. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse NS072838 und NS079701 an D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM an D.G. und OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship an C.C. unterstützt. Wir schätzen auch die Unterstützung durch den Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) und das OSUCCC Translational Therapeutic Program, den Seed Grant und die Start-up-Mittel für D.G.

1. Nachweis von Endogene SCAP Protein in menschlichen Zellen <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Seed ~ 1 × 10 6 U87 - Zellen in einer 10 cm - Schale mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , supplementiert mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 h vor der Behandlung. </li><li> Wasche die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), dann schaltet Zellen frisches DMEM-Medium mit oder ohne Glucose (5 mM) für 12 Stunden. </li></ol></li><li> Herstellung von Zellmembranfraktionen und Kernextrakten <ol><li> Wasche die Zellen einmal mit PBS, schaben in 1 ml PBS und Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in einem eiskalten Puffer , enthaltend 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM Natrium - Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Natrium Ethylenglycol tetraessigsäure (EGTA), 250 mM Saccharose, und eine Mischung von Proteaseinhibitoren (5 μg / ml Pepstatin A, 10 &amp; mgr; g / ml Leupeptin 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 25 ug / ml N-Acetyl-Leu-Leu-Norleu-al (ALLN)) für 30 min auf Eis. </li><li> Passieren Zellextrakten durch eine 22 G x 1 1/2 Nadel 30mal und Zentrifuge bei 890 × g bei 4 ° C für 5 min, zu isolieren Kernen. </li><li> Verwenden Sie den Überstand zur Abtrennung von Membranfraktionen (Schritt 1.2.7). Resuspendieren Kernpellet in 0,1 ml Puffer C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v / v) Glycerol, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM Natrium - EDTA, 1 mM Natrium - EGTA und eine Mischung aus Protease-Inhibitoren (5 ug / ml Pepstatin A, 10 &amp; mgr; g / ml Leupeptin, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, und 25 &amp; mgr; g / ml ALLN)). </li><li> Drehen, um die Suspension bei 4 ° C für 60 min und zentrifugieren bei 20.000 xg in einer Mikrozentrifuge für 20 min bei 4 ° C. Der Überstand wird als &quot;Kernextrakte&quot; bezeichnet. </li><li> Erhitzen Sie die Kernextrakten bei 100 ° C für 10 min mit 5-fach-Ladepuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 12,5% β-Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau) vor einer SDS-PAGE unterzogen wird. </li><li> Zentrifugieren Sie den Überstand von der ursprünglichen 890 × g Spin bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Für die anschließende Western Blot-Analyse, um das Pellet in 0,1 ml SDS-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM Natrium-EDTA, lösen und 1 mM Natrium EGTA). Dies wird als &quot;Membranfraktion&quot; bezeichnet. HINWEIS: Wir verwenden 20.000 × g für 20 min Membranen zu pelletieren. 100.000 × g für 10 - 20 min wurde in den Zeitungen von der Brown und Goldstein Labor 15 verwendet. </li><li> Inkubieren der Membranfraktion bei 37 ° C für 30 min und bestimmen, um die Proteinkonzentration durch Bradford-Protein-Assay. 1 &amp; mgr; l 100x Bromphenolblau-Lösung, bevor die Proben SDS-PAGE unterzogen wird. </li><li> Last 25-50 ug Gesamt - Membranproteine auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 39. Führen Sie das Gelbei 80 V für 15 min, dann auf 130 V zu ändern und für eine weitere 115 min laufen. Übertragen bei 140 mA für 130 min 39. <ol><li> Für die Western-Blot-Analyse, verwenden anti-SCAP Antikörper die gesamte SCAP Protein nachzuweisen. Verwenden Protein (PDI), ein ER- lokalisiertes Protein 40, als eine interne Kontrolle. Verwenden anti-SREBP-1-Antikörper die N-terminale Bande von SREBP-1 zu erkennen. Verwenden Sie Lamin A als interne Kontrolle für Kernextrakten 31. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Analyse der SCAP N -glycosylation in menschlichen Zellen <ol><li> Zellkultur, Transfektion und Behandlung <ol><li> Für Membrananalyse, seed ~ 1 × 10 6 HEK293T - Zellen in einer 10 cm - Schale mit DMEM ergänzt mit 5% FBS und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden vor der Transfektion. </li><li> Verdünnen Sie 4 - 8 ug GFP-SCAP - Plasmid (ein Geschenk von Dr. Peter Espenshade) 22 in 1 ml Serum Medium reduziert und vorsichtig mischen. </li><li> In 8-16 &amp; mgr; l DNA-Transfektionsreagenz durch direktes Pipettieren in die 1 ml reduziert Serum Medium Plasmide enthalten, und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren des Transfektionsreagenz / Plasmid-Komplex für 25 min bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen Transfektionskomplex zu den Zellen mit frischem Medium und weiterhin Kultur für 24 Stunden bei 5% CO 2 und 37 ° C. </li><li> Wasche einmal mit PBS und zu behandeln , die Zellen für 12 h mit oder ohne Glucose (5 mM) in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin (1 ug / ml), eine n -glycosylation Inhibitor. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Zellmembran Pellets wie in den Schritten 1.2.1 beschrieben, 1.2.2, 1.2.3 und 1.2.7. </li><li> Der Nachweis von SCAP N -glycosylation <ol><li> Trypsin Proteolyse <ol><li> Resuspendieren der Membranpellets aus Zellen GFP-SCAP in 114 ul Puffer , enthaltend 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4) überexprimieren, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM Natrium - EDTA und 100 mM NaCl. </li><li> Inkubiere 5781; l Aliquots von Membranproteinen in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 &amp; mgr; l Trypsin (1 ug / ul) in einem Gesamtvolumen von 58 &amp; mgr; l für 30 min bei 30 ° C. </li><li> Stop Reaktionen durch Zugabe von 2 ul (400 Einheiten) von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor. </li></ol></li><li> Deglycosylation von Peptid- N- Glycosidase F (PNGase F) <ol><li> Für eine nachfolgende Behandlung mit PNGase F, mit 10 ul Lösung mit 3,5% (wt / vol) SDS und 7% (Vol / Vol) 2-Mercaptoethanol zu jeder Probe enthält. </li><li> Nach dem Erhitzen bei 100 ° C für 10 min, fügen sequentiell 7 ul 0,5 M Natriumphosphat (pH 7,5), 7 ul 10% (v / v) Nonidet P-40 mit 12 × Protease-Inhibitoren, und 2 &amp; mgr; l (0,5 U / &amp; mgr; l) von PNGase F. </li><li> Nach Inkubation bei 37 ° C für 3 h, Stopp Reaktionen durch die Zugabe von 5x Ladepuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 12,5% β-Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau). Erhitzen Sie die Mischungen bei 100 ° C für 10 min und nach SDS-PAGE. Last 25-50 ug Gesamt - Membranproteine auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 39. Führen Sie das Gel bei 80 V für 15 min, dann auf 130 V für einen weiteren 115 min ändern. Übertragen bei 140 mA für 130 min. </li><li> Für die Western - Blot, verwenden 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) Antikörper -glycosylation N und Gesamt SCAP Protein nachzuweisen. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Nachweis von SCAP Handel von ER zum Golgi durch Verwendung von GFP-SCAP in menschlichen Zellen <ol><li> Seed 2,5 × 10 5 U87 - Zellen in einer 60 mm Schale mit DMEM ergänzt mit 5% FBS und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 h vor der Transfektion. </li><li> Verdünnen Sie 4 ug GFP-SCAP-Plasmid in 0,5 ml reduziert Serum Medium und mischen. </li><li> In 8 ul DNA-Transfektionsreagenz durch Pipettieren direkt in 0,5 ml reduziert Serum Medium Plasmide enthalten, und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren des Transfektionsreagenz / Plasmid-Komplex für 25 min bei RaumTemperatur. </li><li> Hinzufügen Transfektionskomplex zu den Zellen mit frischem Medium und weiterhin Kultur für 24 Stunden bei 5% CO 2 und 37 ° C. </li><li> Reseed 5 - 10 × 10 4 Zellen in einer 6-Well - Platte , die eine Glasdeckglas (22 mm × 22 mm) und weiter zur Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden enthält. </li><li> Wasche einmal mit PBS und zu behandeln, die Zellen für 12 h mit oder ohne Glucose (5 mM) in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin (1 ug / ml). </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fixieren in 4% Formaldehyd für 10 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, kehren Sie die Deckgläser, montieren Sie auf Objektträger zusammen mit Antifade Reagenz und versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack. </li><li> Überprüfen Sie die GFP-SCAP Handel mit einem 63X -Ölimmersionsobjektiv in einem Laser - Scanning - konfokalen Mikroskop 41. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von Membranfraktionen in menschlichen Zellen und für die Herstellung der Proben für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western - Blot verwendet wird . Wir bieten weiterhin ein Verfahren SCAP Handel zu überwachen, indem GFP-Markierung und der konfokalen Mikroskopie. Das Verfahren ist speziell verwendete Membranprotein zu analysieren und ist ein wichtiges Instrument SCAP N -glycosylation und Menschenhandel zu un...

Deregulation des Fettstoffwechsels ist ein gemeinsames Merkmal von Krebs und Stoffwechselerkrankungen 1-6. Bei diesen Verfahren Sterol regulatorische Element-bindende Proteine (SREBPs), eine Familie von Transkriptionsfaktoren, eine wichtige Rolle spielen , um die Expression von Genen , wichtig für die Aufnahme und die Synthese von Cholesterin, Fettsäuren bei der Kontrolle und Phospholipide 7-10. SREBPs, einschließlich SREBP-1a, SREBP-1c und SREBP-2, werden als inaktive Vorstufen synthetisiert, 7 durch zwei Transmembrandomänen an das endoplasmatische Retikulum (ER) -Membran binden. Der N-Terminus von SREBPs enthält eine DNA-Bindungsdomäne für die Transaktivierung von Zielgenen 11. Der C-Terminus von SREBP Vorläufer bindet an SREBP Spaltungs-aktivierendes Protein (SCAP) 12,13, einem polytopen Membranprotein , das eine zentrale Rolle in der Regulation der SREBP Stabilität und Aktivierung spielt 14-16. Die Umsettation der Transkriptionsfunktion erfordert die Translokation des SCAP / SREBP - Komplexes aus dem ER zum Golgi, wo zwei Proteasen sequentiell SREBP spalten und dessen N-terminales Fragment freizusetzen, die dann in den Kern 7 für die Transaktivierung von Genen lipogenic eintritt. Bei diesen Verfahren steuern die Pegel von Sterolen in der ER - Membran den Ausgang des SCAP / SREBP - Komplexes aus dem ER 7,17. Unter hohem Sterin Bedingungen bindet Sterin SCAP oder ER-resident Insulin-induzierte Gen-Protein-1 (Insig-1) oder -2 (Insig-2), die Verbesserung der Vereinigung von SCAP mit Insigs, die die SCAP / SREBP-Komplex in der Retain ER 18-20. Wenn Sterin-Spiegel senken, distanziert SCAP mit Insigs. Dies führt zu einer SCAP Konformationsänderung, die SCAP Wechselwirkung mit gemeinsamen Hüllproteine ​​(COP) II-Komplexes ermöglicht. Der Komplex vermittelt die Einbindung des SCAP / SREBP Komplexes in die angehenden Bläschen und lenkt seinen Transport aus dem ER zum Golgi 21,22. Nach TransLocation zum Golgi, SREBPs sequentiell von Standort 1 und Standort-2 - Proteasen gespalten, was zur Freisetzung des N-Terminus 7,23-29. SCAP Protein trägt drei N -verknüpftem Oligosaccharide an Asparagin (N) positioniert N263, N590 und N641 15. Wir vor kurzem ergeben , dass Glukose-vermittelten N -glycosylation von SCAP in diesen Seiten eine Vorbedingung ist für SCAP / SREBP Handel vom ER zum Golgi unter niedrigen Sterin Bedingungen 30-32. Der Verlust der SCAP Glykosylierung über Mutation aller drei Asparagin Glutamin (NNN zu QQQ) deaktiviert den Handel des SCAP / SREBP komplex und führt zur Instabilität der SCAP - Protein und die Verringerung der SREBP Aktivierung 31. Unsere jüngsten Daten zeigen auch , dass SREBP-1 ist stark in Glioblastoma aktiviert und reguliert durch SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1-Signalisierung zeichnet sich als eine neue Strategie malignen Erkrankungen und Stoffwechsel s zu behandelnyndromes 1,3,35-38. Daher ist es wichtig , eine effektive Methode zu entwickeln SCAP - Protein und N -glycosylation Ebenen und überwachen ihre Handels mit menschlichen Zellen und Geweben Patienten zu analysieren. Die luminalen Bereich von SCAP - Protein (Aminosäuren 540-707) in der ER enthält zwei N -glycosylation Stellen (N590 und N641) , die von Proteolyse geschützt sind , wenn intakten Membranen mit 15 Trypsin behandelt werden. Dieses luminalen Fragment ein Molekulargewicht von ~ 30 kDa , das klein genug ist , um die Auflösung der einzelnen glykosylierten Varianten SCAP durch Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 15,31 zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Verfahren N -glycosylation von SCAP und das Gesamtprotein in menschlichen Zellen zu detektieren. Dieses Protokoll wird von der Methode in den Publikationen von der Brown und Goldstein Labor beschrieben abgeleitet 15 und unsere jüngste Veröffentlichung 31. Das Protokoll kann in t verwendet werdener studieren von SCAP-Protein aus Säugerzellen.

<table><tbody><tr><td>X-treme GENE HP DNA-Transfektionsreagenz</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMI medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCAP (9D5) Antikörper&nbsp; &nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antikörper&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>SREBP-1 Antikörper (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>PDI Antikörper (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A Antikörper (H-102)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>SCAP Antikörper (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM) ohne Glukose, Pyruvat und Glutamin&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>Fügen Sie vor Gebrauch 1 mM Pyravat und 4 mM Glutamin hinzu</td></tr><tr><td>22 G x 1 1/2 Nadel</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Lösung 0,5 M pH 8,5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0,5 M steril (pH 8,0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo</td><td>scientific SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>Prolong-Gold-Antifading-Reagenz mit Dapi</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von scap<em&gt; n</em&gt; -glycosylation und handel in menschlichen zellen

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Erhöhte Lipogenese ist ein häufiges Merkmal von Krebs und Stoffwechselerkrankungen. Sterol-regulatorische Elementbindungsproteine (SREBPs), eine Familie membrangebundener Transkriptionsfaktoren, die die Expression von Genen steuern, die für die Synthese von Cholesterin, Fettsäuren und Phospholipiden wichtig sind, werden bei diesen Erkrankungen häufig hochreguliert. Bei der nukleären Translokation des SREBP spielt das SREBP-spaltungsaktivierende Protein (SCAP) eine zentrale Rolle beim Transport von SREBP vom endoplasmatischen Retikulum (ER) zum Golgi und bei der anschließenden Aktivierung der Proteolyse. Kürzlich haben wir aufgedeckt, dass die Glukose-vermittelte N-Glykosylierung von SCAP eine Voraussetzung für den Austritt von SCAP/SREBP aus dem ER und die Bewegung in den Golgi ist. Die N-Glykosylierung stabilisiert SCAP und steuert den SCAP/SREBP-Transport. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von Membranfraktionen in humanen Zellen und für die Aufbereitung der Proben für den Nachweis der SCAP-N-Glykosylierung und des Gesamtproteins mittels Western Blot. Darüber hinaus stellen wir eine Methode zur Überwachung des SCAP-Transports mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zur Verfügung. Dieses Protokoll eignet sich für die Untersuchung der SCAP-N-Glykosylierung und des Transports in Säugetierzellen.

Figur 1 zeigt den Nachweis von endogenem SCAP Protein und SREBP-1 Kernform in humanen Glioblastom U87 - Zellen als Reaktion auf Glucose - Stimulation durch Western - Blot verwendet wird . Das Membranprotein SCAP ist in der &quot;Membranfraktion&quot; detektiert. Der Kern Form (N-terminal) von SREBP-1 ist in den &quot;Kernextrakten&quot; erkannt. Die Höhe der SCAP Protein (PDI dient als eine interne Kontrolle der ER-Membran-Proteine) und SREBP-1 Kernform werden durc...

Wir beschreiben eine modifizierte Methode zur Membranfraktion isoliert von menschlichen Zellen und die Probenvorbereitung für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western - Blot verwendet wird . Wir stellen ferner eine GFP-Markierungsverfahren SCAP Handel mittels konfokaler Mikroskopie zu überwachen. Dieses Protokoll kann in regelmäßigen biologischen Laboratorien verwendet werden.

Analyse von SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen einfachen Ansatz zur Analyse der N-Glykosylierung von SCAP und ihres Transports in menschlichen Zellen bereitzustellen. Diese Methode dient der Untersuchung der N-Glykosylierung von SCAP, die für den Transport von SCAP sowie die Aktivierung des SREBP-vermittelten Lipidstoffwechsels in Säugerzellen unerlässlich ist. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode unter Verwendung von Lektinen bietet unsere Methode ein einfaches Verfahren zur Identifizierung der N-Glykosylierung von SCAP, bei dem die Verschiebung der Wanderung nach Entfernung des N-Glykans mittels PNGase detektiert wird.Obwohl diese Methode Einblicke in Krebserkrankungen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, wie beispielsweise kardiovaskuläre Erkrankungen und Stoffwechselstörungen. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine mal 10 hoch 6 U87-Zellen in einer 10-Zentimeter-Schale mit DMEM, das mit 5 % FBS ergänzt ist, ansäen und die Zellen vor der Behandlung 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Waschen Sie anschließend die Zellen einmal mit PBS.Danach das PBS durch frisches DMEM-Medium mit oder ohne Glukose für 12 Stunden erset

analysis-of-scap-n-glycosylation-and-trafficking-in-human-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Eine spezifische und sensitive Methode, um Einblick in die Expression von Glykosphingolipid Antigene Immunsystem Organe und Zellen zu gewinnen beschrieben. Das Verfahren nutzt die Ionenfallenmassenspektrometer ermöglicht stufenweise Fragmentierung Glycosphingolipid Moleküle zur Strukturanalyse gegenüber chemisch synthetisierten Standard.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Wir beschreiben einen Standardantikörperfärbung Protokoll für den Einsatz in der Mikroskopie , die Membran Expression und Lokalisation von Gangliosiden in ruhenden und aktivierten humanen naiven CD4 + T - Zellen zu bestimmen. mit &lt;40.000 Zellen sind auch Echtzeit-PCR-Experimente beschrieben, die keine zusätzlichen Low-Input-RNA-Kits erfordern.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

Ansätze für die biophysikalischen und strukturelle Charakterisierung von Glykoproteinen präsentieren wir mit der Immunglobulin-Falte Biolayer Interferometrie, Isothermen Titration Kalorimetrie und Röntgen-Kristallographie.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Präsentiert wird hier ein Protokoll, das ein in vitro neural-endotheliales Kokultursystem und die metabolische Einbeziehung von Sialoglycan mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen kombiniert, um primäre neuronale Stamm- und Vorläuferzellen zu erweitern und ihre Oberfläche zu beschriften. sialoglycoproteinzur Bildgebung oder Massenspektrometrieanalyse von Zelloberflächenmarkern.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Retrograder Transport von Proteinen von der Zelloberfläche an die Golgi unbedingt Membran Homöostase. Hier beschreiben wir eine Methode um biochemisch Zelle Oberfläche-Golgi Transport von rekombinanten Proteinen mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen zu analysieren.

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) verändern Proteinstrukturen und -funktionen. Methoden zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTM-Typen können die Abdeckung in Analysen maximieren. Wir präsentieren ein Protokoll mit dual-funktioneller Ti(IV)-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von Massenspektrometrie zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse der Protein-N-Glykosylierung und Phosphorylierung in Pankreasgeweben.

Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe

Dieses Protokoll beschreibt verschiedene Methoden, die bei der Untersuchung der ATG9A-Biologie hilfreich sein können, einschließlich Immunfluoreszenz, gefolgt von Bildanalyse, Überexpressionsüberlegungen zu transienten und der Untersuchung des ATG9A-Glykosylierungsstatus mittels Western Blot.

Bildgebung von ATG9A, einem mehrspannigen Membranprotein

Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die umfassende Einblicke in das heterogene Glykoproteom in komplexen Tumormikroumgebungen bietet, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Hier schlagen wir ein einfaches Protokoll vor, das metabolisches Oligosaccharid-Engineering, Click-Chemie und Expansionsmikroskopie kombiniert und die Biobildgebung von intrazellulären sialylierten N-Glykoproteinen mit verbesserter Auflösung unter Verwendung von Routinemikroskopiegeräten ermöglicht.

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Erfahren Sie eine vereinfachte Methode zur Analyse der SCAP N-Glykosylierung und des Traffickings in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung lipidmetabolischer Prozesse mittels Western Blot und konfokaler Mikroskopie.

Analyse von SCAP

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