Name: SCAP의 분석 N 인간 세포의 -glycosylation 및 매매 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 학습하세요 인간 세포에서 SCAP의 N-glycosylation 및 매매 분석 방법을. 막 분리, 웨스턴 블롯, 공초점 현미경을 활용하여 지질 대사 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 Mike S. Brown 박사와 Joseph L. Goldstein 박사가 그들의 출판물에 설명된 방법에 따라 이 방법을 발표하는 데 동의해 준 것에 대해 감사드립니다. GFP-SCAP 플라스미드를 공유해 주신 Peter Espenshade 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 D.G.에 대한 NIH 보조금 NS072838 및 NS079701, D.G.에 대한 American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM, C.C.에 대한 OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. 또한 Ohio State Neuroscience Core(P30 NS038526) 및 OSUCCC Translational Therapeutic Program 시드 보조금 및 D.G.에 대한 스타트업 펀드의 지원에 감사드립니다.

인간의 세포 1. 검색 내생의 SCAP 단백질 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 시드 ~ 1 × 106 U87의 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)와 10cm 접시에 세포는 처리 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세포를 세척 한 다음 12 시간 동안 (5 mM)을하거나하지 않고 새로운 글루코스 DMEM 배지에 세포를 전환. </li></ol></li><li> 세포 막 분수 및 핵 추출물의 제조 <ol><li> 세척 세포는 한 번 PBS로 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 1 ml의 PBS로 긁어, 원심 분리기. </li><li> 된 10 mM HEPES-KOH (PH 7.6), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 mM의 나트륨 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA), 250 mM의 함유 빙냉 완충액에서 재현 탁 셀 수 크로스, 및 프로테아제 억제제의 혼합물 (5 μg / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 25 μg의 / ㎖ N 아세틸 레우-의 Leu-Norleu-AL 30 분 (ALLN)) 얼음 에다가요. </li><li> 핵을 분리하는 5 분 동안 4 ° C에서 890 XG에 22 G의 X를 통해 1 1/2 바늘 30 회 원심 분리기를 세포 추출물을 전달합니다. </li><li> 막 분획 (단계 1.2.7)의 분리 상층 액을 사용합니다. 버퍼 C (20 mM의 HEPES / KOH pH를 7.6, 0.42 M의 NaCl, 2.5 % (v / v) 글리세롤, 0.1 ml의 핵 펠렛을 재현 탁 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 1 mM의 나트륨 EGTA 및 혼합물 단백질 분해 효소 억제제 (5 μg의 / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 PMSF, 1 mM의 DTT, 25 μg의 / ㎖ ALLN)). </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안의 microcentrifuge에 20,000 XG에서 60 분 원심 분리기 4 ° C에서 정지를 돌립니다. 상청액 &quot;핵 추출물&quot;로 지정된다. </li><li> (5 배 로딩 버퍼 10 분 (31)를 100 ° C에서 핵 추출물을 가열SDS-PAGE를 실시하기 전에 2.5 mM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β-머 캅토 에탄올, 청색 0.05 % 브로 모 페놀). </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에서 원래 890 XG에 스핀에서 뜨는을 원심 분리기. 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해, 0.1 SDS 용해 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 100 mM의 염화나트륨, 1 % (v / v)의 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 1 mM 나트륨 EDTA ml의 1의 펠릿을 용해 mM의 나트륨 EGTA). 이것은 &quot;막 분수&quot;지정됩니다. 참고 : 우리는 막 펠렛 20,000 XG에 20 분을 사용합니다. 10 10 XG - 20 분은 브라운과 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 논문에 사용되어왔다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C의 막 분획을 부화 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 결정한다. SDS-PAGE에 샘플을 실시하기 전에 1 ㎕의 100 배 브로 모 페놀 블루 솔루션을 추가합니다. </li><li> 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 전체 막 단백질 50 μg의 -로드 (25). 젤을 실행80 V에서 15 분 동안, 다음 130 V로 변경하고 다른 115 분 동안 실행합니다. 130 분 39 140mA에서 전송합니다. <ol><li> 웨스턴 블롯 분석을 위해, 전체 SCAP 단백질을 검출하기 위해 항 SCAP 항체를 사용한다. 내부 통제로, 단백질 이황화 이성화 효소 (PDI), 응급실 상주 단백질 (40)를 사용합니다. SREBP-1의 N 말단 대역을 검출하도록 안티 SREBP-1 항체를 사용한다. 핵 추출물 (31)에 대한 내부 통제로 라민를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 인간의 세포 2. 분석 SCAP의 N의 -glycosylation <ol><li> 세포 배양, 형질 및 치료 <ol><li> 멤브레인 분석을 위해, DMEM와 10cm 접시 시드 ~ 1 × 106 HEK293T 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 혈청 배지를 감소 1 ml의 8 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 (박사 피터 Espenshade의 선물) (22) 부드럽게 혼합 - 4 희석. </li><li> 플라스미드를 포함하는 혈청 배지를 감소 1ml를 직접 피펫 팅하여 16 μl의 DNA 형질 전환 시약 부드럽게 혼합 - 8을 추가합니다. </li><li> 실온에서 25 분 동안 형질 감염 시약 / 플라스미드 복합체 인큐베이션. </li><li> 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다. </li><li> PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)는 N -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다. </li></ol></li><li> 단계 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 및 1.2.7에 설명 된대로 세포막 알약을 준비합니다. </li><li> SCAP의 N의 -glycosylation의 검출 <ol><li> 트립신 단백질 분해 <ol><li> 10 mM의 HEPES · KOH (PH 7.4), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 100 mM의 NaCl을 함유하는 완충액 114 μL에 GFP-SCAP 과발현 세포 막 펠렛을 재현 탁. </li><li> 57 품어81에서 30 ° C에서 30 분 동안 58 μl의 총 부피의 부재 또는 트립신 1 μL (1 μg의 / μL)의 존재 하에서 막 단백질의 리터 씩. </li><li> 대두 트립신 억제제 2 μL (400 부)을 첨가하여 반응을 중지. </li></ol></li><li> 펩티드 - N- 글리코시다 제 F에 의한 탈 글리코 실화 (MALDI 스펙트럼은 PNGase F) <ol><li> MALDI 스펙트럼은 PNGase F 후속 처리에 대해서는 3.5 % (중량 / 부피) SDS 7 % (부피 / 부피)를 포함하는 용액 10 ㎕를 각 샘플에 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 가열 한 후, 연속적으로 0.5 M 인산 나트륨 (PH 7.5), 10 % (v / v)의 Nonidet 12 × 프로테아제 억제제와 P-40, 2 μL 7 μL 7 μL (0.5 U 추가 MALDI 스펙트럼은 PNGase F.의 / μL) </li><li> 3 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 후, 5 배 로딩 완충액 (312.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β 머 캅토 에탄올, 0.05 % 브로 모 페놀 블루)를 첨가하여 반응을 중지. 10m 100 ° C의 혼합물을 가열및 SDS-PAGE에 따라. 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 총 멤브레인 단백질의 25-50 μg의로드. 다음 다른 115 분 동안 130 V로 변경, 15 분 동안 80 V에서 젤을 실행합니다. 130 분 동안 140mA에서 전송합니다. </li><li> 웨스턴 블롯를 들어, N의 -glycosylation 총 SCAP 단백질을 검출하기 위해 10 μg의 / ㎖ 방지 SCAP (9D5) 항체를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 인간의 세포에서 GFP-SCAP를 사용하여 검출 골지에 ER에서 SCAP 인신 매매의 (3) <ol><li> DMEM와 60mm 접시 시드 2.5 × 105 U87 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 0.5 ml의 4 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 감소 혈청 배지를 희석 혼합한다. </li><li> 직접으로 0.5 ml의에게 플라스미드를 포함하는 감소 된 혈청 배지를 피펫 팅에 의해 8 μl의 DNA 형질 전환 시약을 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 방에서 25 분 동안 형질 전환 시약 / 플라스미드 복합체를 품다온도. </li><li> 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다. </li><li> 유리 커버 슬립 (22mm × 22mm)를 포함하는 6 웰 플레이트에 10 × 10 4 세포와 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 문화를 계속 - 5 시드. </li><li> PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다. </li><li> PBS로 한 번 세포를 씻으 10 분 동안 4 % 포름 알데히드에 고정합니다. </li><li> 의 커버 슬립을 반전, PBS로 세포를 세 번 씻으 antifade 시약과 함께 슬라이드에 장착하고, 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (41)의 63X 기름 침지 목표를 사용하여 GFP-SCAP 거래를 확인합니다. </li></ol>

<ol><li>Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metabolism+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor metabolism of malignant gliomas.</a> Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).</li>
<li>Moon, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scap%2FSREBP+pathway+is+essential+for+developing+diabetic+fatty+liver+and+carbohydrate-induced+hypertriglyceridemia+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals.</a> Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).</li>
<li>Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+emerges+as+a+promising+target+for+malignant+glioma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy.</a> CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+agonist+AICAR+inhibits+the+growth+of+EGFRvIII-expressing+glioblastomas+by+inhibiting+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).</li>
<li>Menendez, J. A., Lupu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+synthase+and+the+lipogenic+phenotype+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).</li>
<li>Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK%3A+A+metabolic+checkpoint+that+regulates+the+growth+of+EGFR+activated+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas.</a> Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).</li>
<li>Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sensors+for+membrane+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein sensors for membrane sterols.</a> Cell. 124, 35-46 (2006).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+Roles+for+SREBP+in+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Expanding Roles for SREBP in Metabolism.</a> Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).</li>
<li>Nohturfft, A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+lipid+metabolism+in+membrane+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).</li>
<li>Jeon, T. I., Osborne, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBPs%3A+metabolic+integrators+in+physiology+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).</li>
<li>Sato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+membrane+attachment%2C+DNA+binding%2C+and+transcriptional+activation+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+protein-1+%28SREBP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1).</a> The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).</li>
<li>Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+at+site-1+requires+interaction+with+SREBP+cleavage-activating+protein.+Evidence+from+in+vivo+competition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).</li>
<li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+complexes+between+the+COOH-terminal+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+and+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).</li>
<li>Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+resistance+in+CHO+cells+traced+to+point+mutation+in+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein.</a> Cell. 87, 415-426 (1996).</li>
<li>Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+SREBP+cleavage-activating+protein%2C+a+polytopic+membrane+protein+with+a+sterol-sensing+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).</li>
<li>Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+G-to-A+substitution+in+a+single+codon+of+SREBP+cleavage-activating+protein+causes+sterol+resistance+in+three+mutant+Chinese+hamster+ovary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).</li>
<li>Espenshade, P. J., Hughes, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+sterol+synthesis+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of sterol synthesis in eukaryotes.</a> Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+step+in+cholesterol+homeostasis%3A+sterols+promote+binding+of+SCAP+to+INSIG-1%2C+a+membrane+protein+that+facilitates+retention+of+SREBPs+in+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER.</a> Cell. 110, 489-500 (2002).</li>
<li>Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insig-2%2C+a+second+endoplasmic+reticulum+protein+that+binds+SCAP+and+blocks+export+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).</li>
<li>Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+mutations+in+sterol-sensing+domain+of+SCAP+block+interaction+with+insig+and+render+SREBP+cleavage+insensitive+to+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).</li>
<li>Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterols+block+binding+of+COPII+proteins+to+SCAP%2C+thereby+controlling+SCAP+sorting+in+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).</li>
<li>Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+step+in+cholesterol+feedback+localized+to+budding+of+SCAP+from+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes.</a> Cell. 102, 315-323 (2000).</li>
<li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol-regulated+release+of+SREBP-2+from+cell+membranes+requires+two+sequential+cleavages%2C+one+within+a+transmembrane+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment.</a> Cell. 85, 1037-1046 (1996).</li>
<li>Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBP-1%2C+a+membrane-bound+transcription+factor+released+by+sterol-regulated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis.</a> Cell. 77, 53-62 (1994).</li>
<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteolytic+pathway+that+controls+the+cholesterol+content+of+membranes%2C+cells%2C+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).</li>
<li>Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+cleave+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+causes+cholesterol+auxotrophy+in+Chinese+hamster+ovary+cells+with+genetic+absence+of+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein.</a> J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).</li>
<li>Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+of+S2P%2C+a+protein+required+for+intramembranous+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Century+of+Cholesterol+and+Coronaries%3A+From+Plaques+to+Genes+to+Statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins.</a> Cell. 161, 161-172 (2015).</li>
<li>Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocatalytic+processing+of+site-1+protease+removes+propeptide+and+permits+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).</li>
<li>Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAP+links+glucose+to+lipid+metabolism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Oncol%22%5BJournal%5D)">SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells.</a> Mol Cell Oncol. 3, (2016).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+Makes+Fat+by+Talking+to+SCAP%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sugar Makes Fat by Talking to SCAP.</a> Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+through+an+Akt-SREBP-1-dependent%2C+rapamycin-resistant+pathway+sensitizes+glioblastomas+to+antilipogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy.</a> Sci Signal. 2, 82(2009).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR+agonist+promotes+GBM+cell+death+through+inhibition+of+an+EGFR%2FAKT%2FSREBP-1%2FLDLR-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway.</a> Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).</li>
<li>Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SREBP-1-driven+lipid+metabolism+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer.</a> Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).</li>
<li>Bell, E. H., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Malignant+Gliomas%2C+Radiation+Medicine+Rounds%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for malignant gliomas.</a> Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).</li>
<li>Geng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SOAT1+suppresses+glioblastoma+growth+via+blocking+SREBP-1-mediated+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li>
<li>Ru, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+Loop+Regulation+of+SCAP%2FSREBP-1+by+miR-29+Modulates+EGFR+Signaling-Driven+Glioblastoma+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth.</a> Cell Rep. , (2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Uehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylated+protein-disulphide+isomerase+links+protein+misfolding+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration.</a> Nature. 441, 513-517 (2006).</li>
<li>Miyashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+for+intracellular+co-localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins.</a> Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).</li>
<li>Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+extracellular+signaling+utilizing+a+glycoproteomic+approach%3A+lectin+blot+surveys%2C+a+first+and+important+step%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step.</a> Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

본 연구는 인간 세포의 막 분획을 분리과 웨스턴 블롯을 이용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 시료의 준비를위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 더 GFP - 라벨 및 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 구체적으로는, 막 단백질을 분석하는데 사용 된 N SCAP -glycosylation 및 피킹을 조사하기위한 중요한 도구이다. 다른 N -glycan 사슬을 인식하고 N을 -glycosylated 단백질 (42)을 식별하기 위해 각종 렉틴을 사용하는 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 우리의 방법은 SCAP 단백질 단편의 당화를 식별 이주 시프트 단백질 - 결합 N은 -glycan 제거 MALDI 스펙트럼은 PNGase F를 사용하고, 검출 AA 540-707. 렉틴 방법의 한계는 특정 인식하는 렉틴...

지질 대사의 규제 완화는 암과 대사성 질환 1-6의 일반적인 특성이다. 이러한 프로세스에서, 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBPs) 전사 인자의 계열은 흡수 및 콜레스테롤, 지방산의 합성 및 인지질 7-10에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 중요한 역할을한다. SREBP-1a에서, SREBP-1C 및 SREBP-2를 포함 SREBPs는 두 개의 횡단 도메인 (7)의 미덕에 의해 소포체 (ER) 막에 결합 비활성 전구체로 합성된다. SREBPs의 N 말단이 표적 유전자 (11)의 전이 활성화를위한 DNA 결합 도메인이 포함되어 있습니다. SREBP 전구체의 C- 말단 절단 SREBP-활성화 단백질 (SCAP) (12, 13), SREBP 안정성 14-16 활성의 조절에 중추적 인 역할을하는 polytopic 막 단백질에 결합한다. implemen전사 기능 테이션은 두 단백질 분해 효소가 순차적으로 SREBP을 절단하고 지방을 생성하는 유전자 (7)의 전이 활성화의 핵으로 들어간다는 N- 말단 단편을 해제 골지에 응급실에서 SCAP / SREBP 복합체의 전위가 필요합니다. 이 과정에서, ER 막에 스테롤의 수준은 ER 7,17에서 SCAP / SREBP 복합체의 종료를 제어 할 수 있습니다. 높은 스테롤 조건 스테롤은 SCAP 또는 ER 상주 결합 인슐린 - 유도 유전자 단백질 -1 (Insig-1) 또는 -2 (Insig-2)에서 SCAP / SREBP 착체를 보유 Insigs으로 SCAP의 연결을 강화 ER 18 ~ 20. 스테롤 수치가 감소하면, SCAP는 Insigs로 해리. 이것은 일반적인 코트 단백질 (COP) II 단지와 SCAP 상호 작용을 할 수있는 SCAP 구조적 변화로 이어집니다. 복잡한 신진 소포로 SCAP / SREBP 복합체의 결합을 매개하고 골지 (21, 22)에 ER에서의 전송을 지시합니다. transloc시골지에 ATION, SREBPs 순차적으로 N 말단 7,23-29의 출시로 이어지는 사이트 1 및 사이트-2 단백질 분해 효소에 의해 분해된다. SCAP 단백질 N은 아스파라긴에 올리고당을 -linked 세 운반 (N)는 N263, N590과 N641 (15)를 배치합니다. 우리는 최근이 사이트에서 SCAP의 포도당 매개 N의 -glycosylation 낮은 스테롤 조건 30-32에서 골지체로 ER에서 SCAP / SREBP 거래를위한 필수 조건입니다 것으로 나타났습니다. (NNN은 QQQ하는) 글루타민에 세 아스파라긴의 돌연변이를 통해 SCAP의 글리코 실화의 손실 SCAP의 단백질과 SREBP 활성화 (31)의 감소의 불안정성에 SCAP / SREBP의 복잡하고 결과의 인신 매매를 사용하지 않습니다. 우리의 최근의 데이터는 또한 SREBP-1의 높은 아교 모세포종에서 활성화 및 SCAP의 N -glycosylation 4,31,33,34에 의해 규제됩니다 보여줍니다. 타겟팅 SCAP / SREBP-1 신호는 악성 종양과 신진 대사의 치료에 새로운 전략으로 부상1,3,35-38 yndromes. 따라서, SCAP 및 N 단백질의 수준을 분석 -glycosylation 인간 세포 및 환자 조직에서의 피킹을 모니터링하기위한 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요하다. 응급실에서 SCAP 단백질 (아미노산 540-707)의 내강 영역은 그대로 막은 트립신 (15)으로 처리 할 때 단백질 분해로부터 보호되는 두 개의 N의 -glycosylation 사이트 (N590과 N641)가 포함되어 있습니다. 이 내강 단편 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 15,31 SCAP 개별 당화 변형의 해상도를 허용하도록 충분히 작은 ~ 30 kDa의 분자량을 갖는다. 여기서는 N의 SCAP의 -glycosylation 인간 세포에서 전체 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 브라운 및 골드 스타 인 연구소 15하고 최근 출판 (31)로부터의 공보에 기재된 방법으로부터 유도된다. 프로토콜은 t에서 사용될 수있다그는 포유 동물 세포에서 SCAP 단백질의 연구.

<table><tbody><tr><td>X-treme GENE HP DNA 형질주입 시약</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMI 매체</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제</td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCAP (9D5) 항체&nbsp; &nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>SREBP-1 항체 (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>PDI 항체 (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A 항체 (H-102)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>SCAP 항체 (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 변형 된 독수리' 포도당, 피루브산 및 글루타민이 없는 배지(DMEM)&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>사용 전에 1 mM Pyravate와 4 mM Glutamine을 추가하십시오</td></tr>. <tr><td>22 G x 1 1/2 바늘</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 용액 0.5 M pH 8.5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0.5 M 멸균 (pH 8.0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr>dapi <td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td>L-글루타민(200mM)으로<td>금 퇴색 방지 시약 연장</td></tr> Life <tr><td></td><td>Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

scap의 분석<em&gt; n</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

지방 형성 증가는 암과 대사 질환의 일반적인 특징입니다. 스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBPs)은 콜레스테롤, 지방산 및 인지질의 합성에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 막 결합 전사 인자 계열로, 이러한 질병에서 자주 상향 조절됩니다. SREBP 핵 전좌 과정에서 SREBP-절단 활성화 단백질(SCAP)은 소포체(ER)에서 골지체로 SREBP를 이동시키고 후속 단백질 분해 활성화에서 중심적인 역할을 합니다. 최근에 우리는 SCAP의 포도당 매개 N-글리코실화가 응급실에서 SCAP/SREBP가 종료되고 Golgi로 이동하기 위한 전제 조건이라는 것을 발견했습니다. N-글리코실화는 SCAP를 안정화하고 SCAP/SREBP 트래픽을 지시합니다. 여기에서는 인간 세포에서 막 분획을 분리하고 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP N-글리코실화 및 총 단백질을 검출하기 위한 샘플 준비를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 컨포칼 현미경을 사용하여 SCAP 트래피킹을 모니터링하는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 포유류 세포에서 SCAP N-glycosylation 및 trafficking을 조사하는 데 적합합니다.

도 1은 웨스턴 블롯을 사용하여 자극 포도당 응답 인간 아교 모세포종 U87 세포에서 내인성 단백질 및 SCAP SREBP-1 핵 형태의 검출을 나타낸다. 막 단백질 SCAP는 &quot;막 분획&quot;에서 검출된다. SREBP-1의 핵 형태 (N 말단)이 &quot;핵 추출물&quot;에 검출된다. SCAP 단백질의 수준은 현저하게 포도당의 자극에 의해 강화되고, SREBP-1 핵 형태 (PDI는 ER 막 단백질의 내부 대조군으로서 작용). 이러한 결과는 프로토콜 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수 있음을 보여준다. 도 2는 GFP 표지 햄스터 SCAP 발현 HEK293T 세포 자극 tunicamycin 처리 글루코스에 반응하여 SCAP의 N의</em...

우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다.

SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 인간 세포에서 SCAP의 N-당화(N-glycosylation) 및 그 수송(trafficking)을 분석하는 간단한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 포유류 세포 내 SCAP 수송과 SREBP 매개 지질 대사 활성화에 필수적인 SCAP의 N-당화를 분석하는 데 사용됩니다. 렉틴(lectin)을 사용하는 기존 방법과 비교하여, 본 방법은 PNGase를 사용하여 N-글리칸(N-glycan)을 제거한 후 발생하는 이동성 변화(migration shift)를 검출함으로써 SCAP N-당화를 확인하는 단순한 절차를 제공합니다.이 방법은 암 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 심혈관 질환 및 대사 증후군과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 5% FBS가 첨가된 DMEM이 담긴 10 cm 디시에 1×10⁶개의 U87 세포를 접종하고, 처리 전 37 °C 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 그 다음, 세포를 PBS로 한 번 세척합니다.그 후, PBS를 포도당 포함 또는 미포함 신선한 DMEM 배지로 교체하여 12시간 동안 배양합니다. 세포막 분획물과 핵 추출물을 준비하려면, 세포를 PBS로 한 번 세척합니다. 다음으로, 세포를 1 mL의 PBS에 긁어 모은 후 4 °C에서 1,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.그 후, 세포를 얼음처럼 차가운 완충액에 재현탁하여 얼음 위에서 30분 동안 둡니다. 이어서, 세포 추출물을 22-gauge 바늘로 30회 통과시킨 후, 4°C에서 890 ×g로 5분간 원심분리하여 핵을 분리합니다. 그다음 상층액은 막 분획 분리에 사용하고, 핵 펠렛은 0.1 mL의 완충액 C에 재현탁합니다. 이어서 현탁액을 4°C에서 60분 동안 회전 혼합한 후, 4°C에서 20,000 ×g로 20분간 원심분리합니다.그 후, 핵 추출물을 5x 로딩 버퍼와 함께 100 °C에서 10분 동안 가열한 다음 SDS-PAGE를 수행합니다. 이어서 상층액을 4 °C에서 20,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 펠렛을 0.1 mL의 SDS 용해 버퍼에 녹입니다.그 후, 막 분획물을 37 °C에서 30분 동안 배양하고, Bradford 단백질 정량법으로 단백질 농도를 측정합니다. 다음으로, 샘플을 SDS-PAGE로 분석하기 전에 100x 브로모페놀 블루 용액 1 µL를 첨가합니다. 10% SDS-PA

analysis-of-scap-n-glycosylation-and-trafficking-in-human-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

우리는 쉬고 강글리오사이드 활성화 인간 나이브 CD4 + T 세포의 세포막 발현 및 위치 파악을 결정 현미경에 사용하기위한 표준 항체 염색 프로토콜을 설명한다. 또한 실시간 PCR 실험은 &lt;추가 낮은 입력 RNA 키트를 필요로하지 않는 40,000 세포를 사용하는 기술.

CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

여기에 제시된 프로토콜은 체외 신경 내피 공동 배양 시스템과 sialoglycan의 대사 통합을 생체 장태 작용기와 결합하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포를 확장하고 그들의 표면에 레이블을 붙이는 프로토콜입니다 세포 표면 마커의 화상 진찰 또는 질량 분광분석을 위한 sialoglycoproteins.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

이 프로토콜은 면역형광 후 이미지 분석, 일시적인 과발현 고려 사항, 웨스턴 블롯을 사용한 ATG9A 당화 상태 조사를 포함하여 ATG9A 생물학 연구에 도움이 될 수 있는 다양한 방법을 설명합니다.

ATG9A, Multi-Spanning Membrane 단백질 이미징

이 프로토콜은 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 복잡한 종양 미세환경에서 이질적인 당단백질체에 대한 포괄적인 통찰력을 제공하는 통합 오믹스 기술인 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

학습하세요 인간 세포에서 SCAP의 N-glycosylation 및 매매 분석 방법을. 막 분리, 웨스턴 블롯, 공초점 현미경을 활용하여 지질 대사 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

SCAP의 분석

더 많은 동영상 탐색