Name: 하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 하이브리도마 기술을 활용한 쥐 단일 클론 항체 생성 방법을. 면역화, 세포 융합, HAT 및 ELISA 선별을 통해 특이적 항체 생산 세포주를 확립하고, ELISA 및 유세포 분석 등 다양한 생물학적 검출 시스템에 활용할 수 있습니다.

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저자는 독일 연방 교육연구부(BMBF, 보조금 번호: 03IPT7030X, 03IPT703A, 03IP703)가 우리의 프로젝트인 "인공 면역 반응", "낙타류 항체" 및 "항체 기술"에 자금을 지원한 것에 대해 감사를 표합니다. 원고를 교정해 주시고 도움이 되는 의견을 제공해 주신 Burkhard Micheel 교수님께 감사드립니다.

포츠담 대학 (포츠담, 독일)에서 우리의 사육 식민지에서 BALB / C 또는 NMRI 마우스 (뮤스의 musculus)는 단일 클론 항체의 생산을 위해 사용되었다. 동물 연구는 관련 국가 및 국제 가이드 라인에 따라 실시 하였다. 이 연구는 환경, 보건 브란덴부르크 정부 및 소비자 보호 (참조 번호 V3-2347 - A16-4-2012)에 의해 승인되었다. 면역 접합체의 1. 준비 <ol><li> 담체에 항원을 결합하는, 아미노 통해 표준 커플 링 프로토콜을 사용하여 글루 타르 알데히드, N에 의해 같은 카복시 또는 설포 기, - (3- 디메틸 아미노 프로필) - N의 다이이 미드 (EDC) 또는 N - [Y 말레이 미도 ] 숙신이 미드 에스테르 (설포 GMBS). </li><li> : 1 비율 (글루 타르 알데하이드와 예) 커플 링 (13), 1에서 표적 단백질 또는 펩티드와 캐리어 (난 알부민, 소 혈청 알부민 또는 키홀 삿갓 조개 헤 모시)를 사용한다. 대상 홍보를 희석otein 또는 인산 완충 용액 (PBS), 50 mM의 NaHCO3을 버퍼 캐리어 단백질의 펩티드. 볼륨 및 예방 접종을 위해 필요한 양의 농도를 적응. <ol><li> 두 솔루션을 혼합하고 1.25 %의 글루 타르 알데히드를 추가합니다. 혼합하고 실온에서 4 시간 (RT) 동안 시료를 배양한다. 하이 브리 도마 세포를 선택하기 위해, 동일한 면역을하지만, 다른 담체와 순서 비특이적 담체 결합제의 선택을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> (예를 들어, 세파 덱스 G25) 상업적 거친 수지 빠르고 투석을 행하여 커플 링 샘플을 투석. <ol><li> 중공 바늘 1.5 mL의 반응 바이알의 저부를 관통하고, 15 ㎖의 튜브에 배치. 밀봉 바닥에 유리 섬유를 넣고 (0.5 mL를 교정 마크) 조 수지의 300 밀리그램으로 커버. </li><li> 조심스럽게, 1.5 mL의 반응 관에 1 mL의 PBS의 적가를 넣고 유리 울 여전히 구멍을 밀봉되어 있는지 확인합니다. 거친 수지의하자잘 원심 분리기 2 분 500 XG에 열. 이러한 하나의 열은 커플 링 200 μL 샘플을 투석하기 위해 사용될 수있다. 높은 볼륨의 경우, 더 많은 열을 확인합니다. </li><li> 튜브를 변경하고 팽창 거친 수지 상에 커플 링 솔루션을 놓습니다. 원심 분리기 다시 2 분 동안 500 XG에. 튜브에서 전개 용매를 제거하고 예방 접종을 위해 사용합니다. </li></ol></li></ol> 동물의 2. 예방 접종 <ol><li> 예방 접종에 대한 두 개 또는 세 개의 6 ~ 12 주령의 Balb / c 마우스를 선택합니다. </li><li> PBS 200 μL의 면역 접합체의 200 μg의 완전한 Freund&#39;s 보조제의 100 μL (CFA)와 함께 혼합 - 한 동물의 경우, (150)을 준비합니다. 1 ML의 주사기에 솔루션을 짧고가는 바늘로 3 회 (0.6 mm 직경)를 섞는다. 마우스에 복강 내 용액을 주입한다. </li><li> 육주 후 면역 접합체의 같은 양의 부스터 주사를 부여하지만, CFA없이. 합니다 (안와 동 만점) 칠일 후에 혈액과 처리장을실온에서 4 시간 (RT) - (3)에 대해 혈액을 배양하여 혈청 재. <ol><li> 5 분 동안 3,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 혈청 상층 액을 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. -20 ° C에서 보관합니다. 펠렛을 폐기하십시오. </li></ol></li><li> ELISA를 통해 혈청을 분석, 융합을 위해 3 단계에 설명 된대로, 가장 높은 혈청 역가와 마우스를 선택합니다. </li><li> 단지 4 일 융합 전에 보조없이 PBS 300 μL의 면역 접합체의 200 μg의 - 세포 융합에 대비하여, (150)와 마우스를 향상. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> PBS에서 5 μg의 / ㎖ 농도의 항원 용액을 조제하고, 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 μL ELISA 옮긴다. </li><li> 37 ° C 또는 밤새 습기 챔버 4 ° C에서 2 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 수돗물로 플레이트를 3 회 반복한다. 습기 채널에 실온에서 1 시간 동안 잘 당 PBS / 5 % 신생아 혈청 80 μL (NCS)와 우물을 차단호박색. 1시 50분로 시작하는 5 시리즈 : 1의 혈청 희석을 준비합니다. 세포 배양 분석의 경우, 희석 배양 상등액을 사용한다. </li><li> 수돗물로 플레이트를 3 회 반복한다. 피펫 (50)도 당 샘플의 μL 및 습기 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양. 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 접합 염소 항 - 마우스 IgG 항체의 5,000 희석 : 1의 이차 항체 솔루션을 준비합니다. </li><li> 수돗물로 판을 3 회 세척하고 잘 당 이차 항체 용액 50 μL를 추가합니다. 습기 챔버에서 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 신선한 기질 용액을 준비합니다. 0.1 M의 NaH 2 PO 4, 0.1 % 과산화수소의 스톡 용액을 만든다. 5 중량 부에 NaH 2 PO 4, 4 부 과산화수소 및 신선한 기질 용액 1 부 테트라 메틸 벤지딘을 가지고. <ol><li> 수돗물로 판 10 회 반복한다. 피펫 (50) 우물에 신선한 기질 용액 μL 5 부화 - 10 분어두운. </li></ol></li><li> 50 μL 1 MH이 아니라 당 SO 4로 반응을 중지합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 630 nm에서 기준 파장 450 nm에서의 광학 밀도를 측정한다. </li></ol> 골수종 세포 배양 4. 준비 <ol><li> 지금부터, 멸균 조건에서 모든 작업을 수행합니다. </li><li> 세포 배양을위한 새로운 배지를 준비합니다. 10 % 소 태아 혈청 (50 ㎖), 2 mM L- 글루타민 (5 ㎖) 및 50 μM의 메르 캅토 에탄올 (5 mL)로 RPMI1640 500㎖의 보조 식품. 매 7 일 글루타민을 대체합니다. </li><li> 따뜻한 물에 쥐 SP2 / 0 세포의 병을 해동. 200 x g에서 10 분 동안 신선한 배양액을 원심 분리로 10 mL의 세포 용액을 전송. 뜨는을 취소하고 신선한 배양액 1 mL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 25 cm 2 플라스크에서 세포를 옮기고 항온 CO 2, 37 ° C에서 그들을 부화 5 %. 이 75 m에 세포를 확장 2 플라스크 BEF광석 융합. 단계 7에 기재된 바와 같이, 장기간의 저장을 위해 분취 량을 절약. </li></ol> 피더 세포의 5. 준비 <ol><li> (; 예를 들면, CO 2 흡입 국가 및 기관의 지침에 따라) 12 주령 NMRI 마우스를 희생. 모피를 제거하고 70 % 에탄올로 복부를 청소하십시오. </li><li> 복부에 얼음 차가운 RPMI 배지 5 mL를 주입 트위터와 복부를 마사지하고, 피더 세포 현탁액을 대기음. 빈 50 ML의 튜브에 세포를 놓습니다. 다시 한 번이 단계를 수행합니다. 피더 세포 현탁액의 7 ~ 10 mL를 검색 할 수 있습니다. </li><li> 전체 세포 배양 배지 90 ㎖ (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민, 50 μM 머 캅토 에탄올)을 첨가하여 100 mL의 피더 세포 현탁액을 준비한다. 그것을 혼합하고 10 × 96 웰 세포 배양 플레이트에 웰 100 μL / 옮긴다. 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2의 접시를 품어. </li></ol> 6. 셀 퓨전<ol><li> 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입하여 예방 접종을 마우스를 희생하고 비장 (14)를 절제. 엘리사의 양성 대조군으로, 단계 2.3에 설명 된대로, 마음에서 추가 혈액을 타고 혈청을 준비합니다. </li><li> 셀 스트레이너를 통해 비장을 눌러 비장 세포 현탁액을 제조. 전체 세포 배양 배지 20 ㎖까지 입력합니다. 원심 분리에 의해 50 ㎖의 튜브에 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ℃). 상층 액을 버린다. </li><li> 세포 배양 플라스크를 씻어 원심 분리하여 골수종 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ° C) 및 상층 액을 버린다. </li><li> 20 평형 염 완충액 ㎖ (BSS)에서 세포 펠렛을 재현 탁 (125 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 4 mM의 CaCl2를 2.5 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM 트리스 - 염산, pH를 7.4), 원심 분리를 다시. 세탁 세 번 단계를 반복합니다. </li><li> 비장 조정 : 골수종 세포 비, 눈에 의해 제 2 세정 단계 후에 세포를 카운트ST는 BSS 완충액 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 1:10 희석을 확인하고 셀 카운팅 챔버에 10 μL를 전송합니다. 세포를 세어 한 용액으로 세포 농도를 결정한다. </li><li> 1 ㎖의 최종 부피로 세 부품 비장 한 부분 골수종 세포에 BSS 버퍼 내의 세포 수를 조정한다. 세포 현탁액의 200 μL를 가지고 PEG8000 200 μL (BSS 버퍼의 4 ㎖의 1g)와 함께 섞는다. 2mm 직경의 전기 천공 큐벳에 400 μL 전송 펄스 세트 (600-650 V, 25 밀리 초). <ol><li> 펄스 후에 큐벳에서 3 분 동안 실온에서 세포를 배양한다. 세포를 제거하고이를 HAT 보통 100 ㎖ (RPMI 1640, 10 % FCS, 2 mM의 글루타민, 50 μM의 머 캅토 에탄올, 100 μM의 히 포크 산틴, 5.8 μM 아자 세린, 16 μM 티미 딘)와 함께 삼각 플라스크에 적가. </li><li> 1 mL의 배치가 소비 될 때까지 융합 4 번 반복합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 시간 동안 삼각 플라스크를 인큐베이션인큐베이터한다. </li></ol></li><li> 피더 층 세포 도금 전에 하이포크 산틴, 아자 세린 및 티미 딘 다시 세포 현탁액을 보완. 피더 층 플레이트에 웰 당 세포 현탁액 100 μL를 추가하고 37 ° C, 5 % (인큐베이터)에서 CO 2의 접시를 품어. 잘 내에서 최종 농도는 100 μM의 하이포크 산틴, 5.8 μM 아자 세린, 16 μM의 티미 딘을해야합니다. </li><li> 우물은 모노 또는 폴리 클로 날 있는지 확인하기 위해 7 일 후 플레이트의 각 웰에 클론 성장 : 현미경 분석 (10X 대물 렌즈, 10 배 눈 조각 확대)을 수행합니다. 단일 클론 세포는 단일 세포에서 유래 한 세포의 클러스터이다. 폴리 클로 날 세포는 잘 하나의 셀의 다수의 클러스터이다. 7 일 후 전체 미디어를 변경하고 HAT 배지에서 7 일간 다시 품어. </li><li> 모자 매체를 변경하고 전체 세포 배양 배지에서 세포를 배양. 전자를 수행하는 상층 액을 사용하여단계에 기재된 리사 3. 양성 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항체의 생산에 대한 시험에있어서, 24 웰 플레이트에서 팽창되어야한다. 세포 클론 인 경우 제한 희석 (단계 8에서 설명 됨)을 수행해야한다. </li></ol> 하이 브리 도마의 7 Cryoconservation <ol><li> 장기 보관 용 포지티브 및 모노 클론 된 하이 브리 도마를 Cryoconserve. 원심 분리에 의해&gt; 60 % 합류로 24- 웰 플레이트로부터의 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ℃). </li><li> 전체 세포 배양액 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 cryotube로 옮긴다. 동결 매체의 500 μL (RPMI 1640, 20 % FCS, 15 %의 디메틸 설폭 시드)를 추가로 혼합하고, 스티로폼 상자 또는 특수 냉동 상자에 넣어. 3 일간 -80 ° C에서 보관. 삼일 후 cryotube 장기 저장을 위해 액체 질소로 전송 될 수있다. </li></ol> 8. 폴리 클로 날 하이 브리 도마의 희석을 제한 <ol><li> 막개 세포층 문화, 단계 7.1에 설명 된 단계 5에 수확 긍정적 인 클론 세포를 설명한대로. 단계 6.5에 기재된 바와 같이 세포 수를 계산하고, 96 웰 플레이트 10 ㎖의 최종 부피로 10 세포 / ㎖로 세포 수를 조정한다. 100 μL / 웰 상에 공급 층을 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 7 일간 배양 및 현미경 (배율 : 10 배 대물 렌즈, 10 배 눈 조각) 클론 성장을 분석 할 수 있습니다. 단계 3에서 설명한 바와 같이, 배양 상청액의 ELISA를 확인하고, 대량 배양에 적합한 하이 브리 도마 클론을 확인한다. </li></ol> 9. 대중 문화와 단일 클론 항체의 정제 <ol><li> 이 25cm 또는 75cm이 플라스크에 적절한 ELISA 신호로 하이 브리 도마 클론을 전송하고, 배양 상청액 500 ㎖까지 모은다. 특정 항체의 생산을위한 배양 주간 테스트 3 절약 - 단계 7에 기재된 바와 같이, 장기간의 저장을 위해, 하이 브리 도마 당 5 분취한다. </li><li&gt; 원심 배양 상청액 4900 XG에서 15 분 동안 4 ℃ 및 0.45 μm의 필터를 통해 필터링. : 1 비율로 3 버퍼 (4 M NaCl을 2 M 글리신의 NaOH, pH를 8.9) 바인딩 뜨는을 섞는다. </li><li> (: DH 2 O 3 바인딩 버퍼 1 희석) 세척 완충액으로 세척하여 단백질을 열 준비. 칼럼을 통해 단계 9.2에서 뜨는을 전달하고 플로우를 통해 수집합니다. 0.1 M 시트 레이트, pH를 3.5으로 결합 된 항체를 용출 및 트리스 - 염산 500 μL, pH가 9.0 즉시 pH를 중화. </li><li> SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의해 용출 된 항체의 특성, 최종 응용 프로그램을 확인합니다. <ol><li> 5 μL 배 SDS 샘플 로딩 버퍼 (8 % SDS, 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 40 %의 글리세린, 0.015의 추가, 레인 (20 μL 샘플) 당 정제 된 항체 용액의 5 μg의 - SDS 페이지의 경우, 3을 % 브로 모 페놀, 감소)을 5 분 동안 95 ℃에서 프로브를 가열한다. 대조군으로, 정제 된과 동일한 샘플을 사용하여같은 이소하지만 관련이없는 특이성 ntibody. </li><li> , 12.5 % SDS 겔에 샘플을로드 추가 차선에서 흠없는 단백질 사다리의 5 μL를 배치하고, 전기 영동으로 구분합니다. 쿠마 브릴리언트 블루와 젤을 얼룩하고 그 결과를 문서화합니다. 기본 SDS 프로토콜은 1970 15 램 믈리에 의해 설립되었습니다. </li></ol></li></ol>

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저자 Pamela Holzlöhner와 Katja Hanack은 맞춤형 단클론 항체 생성을 제공하는 회사인 new/era/mabs GmbH의 공동 창립자입니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 모노클로 날 항체의 생성은 항체가 대상을 인식해야 할 때, 특히 최종 애플리케이션에 대하여, 강한 상세한 에피토프 분석을 요구한다. 이것은 종종 사용자가 과소 평가 약한 공연 항체에 이르게된다. 융합 프로세스는 특정 하이 브리 도마의 결과가이 시점에서 셀 비율과 활력에 크게 의존하는 것을 의미하는, 항상 랜덤이다. 제한 희석 한 후, 셀은 매우 불안정하며, 세포 증식 및 항체 생산의 엄격한 모니터링을 필요로한다. 방법 문제를 해결할 때 이러한 매개 변수를 신중하게 분석해야한다. 기술의 한계점은 세포주를 생성하는 데 필요한 시간 및 원하는 항체 생산 세포의 선택을 포함한다. 융합 후 염색체의 배체 설정으로 인해 세포가 매우 불안정하고 나중에 다시 반수체하는 세트를 줄일 수 있습니다. 이 수세포가 더이상 항체를 생산하지 일으키는 항체 관련 유전자의 손실을 초래할. 또 다른 제한은 원하는 항체 생산 세포의 선택은 배양 상등액에가 아니라 정제 된 항체 용...

이 프로토콜에 제시된 하이 브리 도마 기술은 처음 쾰러와 1975 년 밀스타인 (1)에 의해 설명하고, 몇 가지 기술적 인 개선을 제외하고 주요 절차는 지난 40 년 2 동안 크게 변경되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은보다 적절한 면역화 전략, 모노클로 날 항체의 생성 표준 방법 및 검증 방법 (ELISA)에 대한 예를 설명한다. 항체는 놀라운 도구 질병 모니터링 및 처리 3에 대한 진단 및 치료 옵션뿐만 아니라 이러한 유세포 자기 세포 분류, 또는 면역 같은 기술적 접근법 광범위한 기여한다. 원하는 목표에 대한 단일 클론 항체의 상용화는 항체 또는 항체 관련 제품 (4)의 거의 셀 수없이 많은 수량 24 개 이상의 서로 다른 웹 데이터베이스의 존재에 의해 설명된다. 2015에서,ntibody 분자 인해 적절한 검증 및 상업적으로 이용 가능한 항체의 특성에 심각한 문제로 국제 논의 5-7의 일부. 표적 항원에 특이적인 항체를 찾기 어렵고 고가 일 수 있고, 종종, 이들은 친 화성 또는 특이성은 필요 없다. 항체를 생성하는 것은 아직 시간이 많이 걸리는이며, 수도 더 나은 하나를 구입하는 것보다 개별적으로 항체를 생산, 개발 및 항체를 확인하는 숙련 된 인력이 필요하지만. 인해 항체 생산은 시간 소모적이며, 경험을 필요로한다는 사실에 결합 분자의 제조를위한 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 가장 일반적으로 사용되는 다른 방법은 파지 디스플레이를 통해 단일 쇄 항체의 재조합 생성한다. 가변 결합 영역의 유전자는 세포로부터 추출하고, 파지의 코트 단백질과 결합된다. 의 S화롯불 체인은 박테리오파지의 표면에 발현 여러 패닝 단계 8에서 상영된다. 단일 사슬 항체의 생산은 다소 빠르지 만 또한 숙련 된 실험자를 필요로한다. 일부 재조합 단일 사슬 항체의 단점은 가난한 안정성 및 체외 진단을위한 적합성의 부족이다. 대부분의 진단 시험에서 검출을위한 된 Fc 수용체 나중에 재조합 단일 쇄 항체에 추가 될 필요가있는 것이 필요하다. 또한, 이것은 시간을 소모하고, 하이 브리 도마 기술보다 훨씬 더 복잡하다. 체외 진단에서 전체 길이 단일 클론 마우스와 토끼 항체는 최선의 선택이 될 입증되었습니다. 면역 접합체의 설계 : 실험실 작업을 시작하기 전에 단일 클론 항체를 생성하는 주요 단계 중 하나는 수행되어야한다. 해결해야 할 질문은 다음과 같습니다 최종 응용 제품에서 대상의 물리적 조성은 무엇입니까이온 및 존재하는 행렬? 대상은 응용 프로그램에서 어떤 농도가 있습니까? 최종 응용 프로그램은 무엇이며, 항체가 충족해야하는 요구 사항은 무엇입니까? 항상 선형 펩티드 단편을 사용하는 경우, 또한 원하는 대상의 최종 선형 에피토프되어야한다는 고려; 그렇지 않은 경우, 항체에 결합하지 않을 것이다. 물론, 스크리닝 방법과 무관하게 항체는 서로 다른 애플리케이션의 서로 다른 형식의 항원을 인식하도록 선택 될 수 있지만, 이것은 매우 정밀하게 검증되어야한다. 이러한 항체 개발 및 유효성 검사는 야심 찬 프로세스입니다 이유입니다. 면역 항원에 대한 포맷의 선택은 항체 개발을위한 기본이며,이 방법의 성공 또는 실패를 결정한다. 생쥐가 중요한 항체를 발현하면, 비장 세포를 분리하여 골수종 세포와 융합된다. 가장 일반적인 골수종 세포주쥐의 모노클로 날 항체 개발은 X63-의 Ag 8.653 (9) 및을 Balb / C 마우스 변형에서 Sp2을 / 0의 Ag (14) (10)이다. 세포는 악성 B 세포 림프종의 자손 그들 자신의 중량 또는 경쇄 중 어느 분비하지 않기 때문에 선택되었다. 1 (골수종 세포 대 비장) 세포를 1:10 내지 10의 비율로 구성 될 수있다. Stoicheva 및 귀 (11)에있어서, (1) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 전기 융합하여 융합이 프로토콜에서, 세포는 3의 비율로 적응시켰다. B 세포와 골수종 세포의 융합은 임의의 공정이다. 따라서, 두 개의 B 림프구 또는 골수종 세포의 하이브리드를 생성 할 수 있지만, 이러한 하이브리드 배양 장기간 생존 할 수 없다. 세포는 하이 브리 도마 세포 융합 의한 피리 미딘 합성 새로이 경로를 사용할 수있는 가능성에 견딜 수있는하여 하이포크 산틴, 아미 노프 테린 및 티미 딘 (HAT)을 둘러 거칠. 월의 생성oclonal 항체, 한 머더 세포 유래 세포주를 얻기 위해 필요하다. monoclonality는 희석 기술 및 세포 증식의 현미경 분석을 제한함으로써 보장된다. 하이 브리 도마 배양 상청액은 ELISA에 의해 주로, 특이 적 항체 생산에 대해 스크리닝 또는 유동 세포 계측법 및 가장 바인더가 선택된다. 대량 배양 및 정제 한 후, 항체 분자는 마침내 특성화 될 수 있으며, 원하는 애플리케이션에 대한 검증.

<table><tbody><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>오브알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>열쇠 구멍 림펫 헤모시아닌</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>반응 바이알, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>중공 바늘</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>유리솜</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 거친</td><td>시그마 Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s 보조제, 완전한</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 플레이트, 96 웰</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 팁 1,000 &마이크로; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 200 &마이크로; L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG 항체</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸벤지딘</td><td>Carl Roth GmbH &</td><td>C0.KG 6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>과산화물/우레아</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>칼 로스 GmbH & C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm2</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-플라스크 75 cm2</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 96%</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation 큐벳, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>하이포잔틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>아자세린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>티미딘</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC 플레이트 96 웰</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC 플레이트 24 웰</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>염색되지 않은 단백질 ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant 블루 R-250</td><td>BioRad 연구소</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

단클론 항체는 보편적인 결합 분자이며 생물 의학 및 연구에 널리 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 결합 분자의 생성은 복잡한 취급과 대안의 부족으로 인해 시간이 많이 걸리고 힘들다. 이 프로토콜의 목적은 하이브리도마 기술을 사용하여 단클론 항체 생성을 위한 하나의 표준 방법을 제공하는 것입니다. 이 기술은 두 단계를 결합합니다. 1단계는 동물에 대한 적절한 면역이고, 2단계는 B 림프구와 불멸의 골수종 세포를 융합하여 항체 분자 생성과 불멸성과 같은 부모 기능을 모두 가진 하이브리드를 생성하는 것입니다. 생성된 하이브리도마 세포를 재복제하고 희석하여 배양 상등액에서 원하는 단클론 항체를 분비하는 안정적인 단클론 세포 배양을 수득했습니다. 상등액은 항원 특이성에 대해 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에서 테스트되었습니다. 적절한 세포 클론을 선택한 후, 원하는 항체 분자를 대량으로 생산하기 위해 세포를 대량 배양으로 전환했습니다. 항체의 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 일상적으로 수행됩니다. 정제 후 항체 분자를 특성화하고 최종 테스트 응용 분야에 대해 검증할 수 있습니다. 전체 프로세스는 8개월에서 12개월의 개발 기간이 소요되며 항체가 원하는 테스트 시스템에서 작동하지 않을 위험이 높습니다.

도 1은 실험실에서 수행 한 면역 용 항원 특이 혈청 역가의 예를 도시한다. 순진한 마우스의 혈청과 비교 5,000,000이 도면에서, 면역 혈청 A 및 B 1:50 내지 1에서 적정 하였다. 항원은 고체 상에 도포하고, 특정의 항체는 POD - 공액 된 염소 항 - 마우스 IG 항체로 검출 하였다. 면역화 된 마우스의 혈청 모두는 나이브 마우스에 비해 상당히 높은 항원 특이 역가를 나타내었다. 하나의 희석에서 신호 5,000 다음 단계, 세포 융합으로 이동하는 것으로 충분하다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 하이 브리 도마의 증식은 세포 클론의 발전에 의한 HAT 선택 7 ~ 10 일 후에 가시적이었다. 이미지 10 일 융합 후 96 웰 플레이트에서 촬영됐다. 세포 클론과 우물의 aminopteri...

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

이 절차의 전반적인 목표는 단클론 항체의 생명공학적 생산을 위한 항체 생산 하이브리도마 세포주를 생성하는 것입니다. 이 방법은 생체 분자의 검출 및 시각화를 위한 특정 바인더를 생성하고 ELISA, 유세포 분석 또는 자기 세포 분류와 같은 효과적인 검출 시스템의 개발을 위해 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사전 정의된 특이성과 지속적인 가용성을 가진 단클론 항체 생산 세포주의 생성을 용이하게 한다는 것입니다.골수종 세포를 준비하려면 쥐 SP2/0 세포가 담긴 바이알을 따뜻한 물에서 해동합니다. 그런 다음 세포를 10mL의 배양 배지로 옮기고 원심분리로 수집합니다. 펠릿을 10mL의 신선한 배양 배지에 다시 현탁시키고 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양하기 위해 25제곱센티미터 플라스크에 파종하고 적절한 횟수의 팽창 후 장기 보관을 위해 세포의 분취량을 보존합니다.피더 세포를 준비하려면 12주 된 NMRI 마우스의 털을 제거하고 70% 에탄올로 복부를 소독합니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 RPMI 배지 5mL를 복강에 주입하고 핀셋을 사용하여 복부를 마사지합니다. 그런 다음 공급세포 현탁액을 제거하고 세포를 새로운 50mL 튜브에 분배합니다.방금 시연한 바와 같이 두 번째 공급세포 수확물을 동일한 50mL 튜브로 옮긴 후 새로운 전체 세포 배양 배지를 사용하여 튜브의 총 부피를 50mL로 가져옵니다. 그런 다음 현탁액을 새 100mL 용기로 옮기고 추가를 반복합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 잘 혼합하고 웰당 100mcL의 세포를 10개의 96웰 세포 배양 플레이트에 파종하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 하룻밤 배양합니다.세포 융합의 경우 주사기 플런저의 앞쪽 끝을 사용하여 40미크론 여과기를 통해 갓 채취한 비장을 50mL 튜브로 누릅니다. 20mL의 전체 세포 배양 배지에 세포를 현탁시킨 다음 원심분리합니다. 다음으로, 5mL 피펫을 사용하여 배양 상등액으로 골수종 세포를 세척하고 원심분리를 위해 부유 세포를 50mL 원추형 튜브로 옮긴 다음 20mL의 평형 염 완충액을 4회 세척합니다.마지막 세척 후, 골수종 세포의 1:1 부피에 비장세포 부피의 3배를 첨가하고 원심분리로 세포 펠릿을 얻습니다. 세포 혼합물을 1mL의 신선 균형 염 완충액에 다시 현탁시키고 200mcL의 세포를 200mcL의 PEG 8000과 혼합합니다. 세포 혼합물을 2mm 직경의 전기천공법 큐벳으로 옮기고 600-

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 중쇄 및 경쇄 유전자를 가진 플라스미드 벡터를 도입하여 포유류 세포에서 항체를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 벡터는 폴리에틸렌과 상호 작용하고 폴리플렉스를 형성하여 세포에 들어갑니다. 나중에, 그들은 개별 단백질로 번역되어 완전한 항체로 조립되어 세포 외 배지로 분비됩니다.

포유류 세포 배양에서 재조합 단클론 항체 생성

이 비디오는 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 막 결합 메탈로펩티다아제인 돼지 아미노펩티다아제 N(APN)에 대한 단클론 항체를 생산하는 분석을 보여줍니다. 마우스에 APN을 주입하면 비장 세포를 채취하여 불멸의 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성합니다. 그런 다음 HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 배지를 사용하여 하이브리도마를 선택하고 증식시켜 다양한 APN 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 생성합니다.

메탈로펩티다아제에 대한 단클론 항체를 생산하기 위한 하이브리도마 기술

이 비디오는 항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술을 보여줍니다. 분리된 항원 특이적 B 세포에서 복제된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 진핵생물 발현 벡터는 폴리플렉스를 사용하여 포유류 세포에 도입됩니다. 일단 세포 내부로 들어가면 이러한 벡터는 번역을 거치고, 그 결과로 생성된 중쇄 및 경쇄 펩타이드는 항체로 조립되어 세포에서 분비됩니다.

항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현되는 재조합 항체 단백질과 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된 단클론 항체는 돼지 아미노펩티다아제 N(APN) 단백질을 인식하고 결합할 수 있습니다.

돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산

C57BL / 6 마​​우스는 HC의 pathogenesis을 연구하고 최상의 모델을 제공하는 데 사용되었습니다. 우리는이 곰팡이에 대한 체액성 면역의 가능성 혜택을 탐구하고 [히스톤 H2B와 열 충격 단백질 60kDa로] 여러 mAbs를 생성 우리가 intraperitoneal 행정부 이후에 그들의 보호 효능에 대한 테스트 것을.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

이 프로토콜은 폴리에틸렌 글리콜 석출에 의해 난황에서 총 IgY의 특정 추출에 대해 설명하고 IgY 기술에 대한 일반적인 정보를 제공합니다.

IgY 기술 : 폴리에틸렌 글리콜의 노른자위에서 치킨 항체의 추출 (PEG) 강수량

배우세요 하이브리도마 기술을 활용한 쥐 단일 클론 항체 생성 방법을. 면역화, 세포 융합, HAT 및 ELISA 선별을 통해 특이적 항체 생산 세포주를 확립하고, ELISA 및 유세포 분석 등 다양한 생물학적 검출 시스템에 활용할 수 있습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

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