Name: Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Öğrenin kalın beyin kesitlerinde Golgi-Cox boyama yöntemiyle uzun dendritik ağaçlara sahip nöronları görüntülemeyi. Bu teknik, fare beynindeki nöron morfolojisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada Yenilik Vakfı (CFI proje numarası 30381) den CDCB bir John R. Evans Liderler Fonu araştırma altyapısını hibe ve tarafından gelen CDCB bir Discovery Grant tarafından desteklenmiştir NSERC dan NJM bir Discovery Grant. ELL bir Ontario Yüksek Lisans Bursu ile ve Guelph Üniversitesi&#39;nde Ontario Veteriner College&#39;dan ovc Burs tarafından desteklendi. CDS NSERC bir Lisans Öğrencisi Araştırma ASİSTANLIK tarafından desteklenmiştir. ALM NSERC bir Alexander Graham Bell Burs tarafından ve Guelph Üniversitesi&#39;nde Ontario Veteriner College&#39;dan ovc Burs tarafından desteklendi.

Yetişkin dişi CD1-türü fare Bu çalışmada kullanıldı. Benzer boyama çeşitli yaşlarda her iki cinsiyeti kullanılarak gerçekleştirilebilir. Deney hayvanları ilke ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak bakıldı ve deneysel protokol Guelph Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Golgi Cox Boyama <ol><li> Beyinlerin Golgi-Cox Emprenye <ol><li> ayrı ayrı, yüksek kaliteli su içine potasyum dikromat ve potasyum kromat eritilerek% 1 Golgi-Cox çözeltisi (ağırlık / hacim) potasyum dikromat,% 0.8 (ağırlık / hacim) potasyum kromat ve% 1 (ağırlık / hacim) cıva klorür yapmak . Çözeltiler karıştırın cıva klorür ekleyin ve sınıf 1 filtre kağıdı kullanılarak nihai çözelti filtre. en fazla bir ay süreyle karanlıkta çözüm saklayın. </li><li> % 5 izofluran kullanılarak fare anestezisi. </li><li> kafaları kesilmek suretiyle fare Euthanize ve hızlı bir şekilde beyin kaldırmak. </li><li> Golgi Cox çözeltisi 17 mL içeren 20 mL&#39;lik bir cam sintilasyon şişesi içine beyin yerleştirin ve 25 gün süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta (0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde / hacim) sukroz (% 30) sükroz, dondurarak saklama 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin cryoprotect. NOT: Aşağıdaki isteğe bağlı üç adım, uzun süreli depolama için bu aşamada beyin dondurmak amacıyla, ana protokol için bir alternatif olarak kullanılabilir. </li><li> kuru buz üzerinde soğutulmuş olan 200 ml izopentan içine daldırarak tüm beyin dondurun. </li><li> -80 ° C&#39;de karanlıkta, 50 ml konik bir tüp ve deposuna dondurulmuş beyin yerleştirin. </li><li> Hazır devam etmek için zaman, 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta sükroz dondurarak saklama koruyucusunun 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin Çözülme. </li></ol></li><li> Beyin Kesit <ol><li> sükroz ve bloktan beyin çıkarınBir ustura kullanılarak beyincik keserek ve beynin kalan kuyruk ucunda düz bir kenar bırakarak kesit için k. </li><li> Isı agar (% 3 (w / v) su içinde) eritilmiş ve erime noktasının biraz üzerinde olduğu kadar soğuması kadar. </li><li> onun kaudal ucu aşağı bakacak şekilde, küçük bir tek kullanımlık tartmak çanak içinde beyin yerleştirin ve beyin kapsayacak şekilde erimiş agar yeterli miktarda ekleyin. </li><li> Agar katılaşmasından sonra, yaklaşık 2 ayrılan fazla agar Döşeme - beyni çevreleyen, 4 mm ve etil siyanoakrilat yapıştırıcı bir miktar kullanarak kuyruk tarafındaki ucu aşağı bakacak şekilde, bir vibratome aşamasına beyin tutkal. </li><li> 400 bir dilim kalınlığında beyin ve bölüm beyin kapsayacak şekilde sükroz dondurarak saklama koruyucusunun yeterli bir miktarı ile vibratome sahne alanı doldurmak - 86 Hz&#39;lik bir titreşim frekansı kullanılarak (incelenecek olan beyin bölgesine bağlı olarak) 500 um ve 0,125 mm / s bir bıçak ilerleme hızı. </li><li> küçük bir boya fırçası kullanarak, Ticari olarak temin edilebilen ağ alt uçlar ihtiva eden bir 6-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya yer beyin kesitleri önceden doldurulmuş 6 10 mL% 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 (w / v) sakaroz ile. </li><li> 4 ° de CO / N karanlıkta bölümleri inkübe edin. </li></ol></li><li> Beyin Bölümler Gelişmekte <ol><li> ağ-alt uçlar kullanılarak, 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 içinde içinde% 2 5 mL paraformaldehid (w / v) (PBD) içeren yeni içine beyin bölümleri aktarın. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın. </li><li> % 2.7 (h / h) amonyum hidroksit, 5 ml ihtiva eden yeni bir kuyu içine aktarın bölümleri. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. o yıkayın5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket na külbütör. </li><li> Iyi Sabitleme A&#39;nın 5 mL içeren yeni içine aktarın bölümler orjinal satın konsantrasyona su 10x içinde seyreltilmiş olduğunu (Malzeme Tablo). 25 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın. </li></ol></li><li> Beyin Bölümler Montaj <ol><li> Küçük bir boya fırçası kullanarak, mikroskop lamı üzerine bölümleri monte. fazla suyu çıkarın ve cımbız ve küçük bir doku kullanılarak agar. Tüm Agar dehidratasyon devam etmeden önce kaldırılmış olduğundan emin olun. </li><li> yaklaşık 45 dakika boyunca (400 um&#39;lik kesitler) ya da 90 dakika (500 um bölümler), oda sıcaklığında hava içinde kurumasına bölümleri izin verin. Not: kuruyana zamanlaması ve uygun seviye kritiktir ve her tespit edilmesi gerekebilirLaboratuar ortam sıcaklığı ve nem miktarına göre değişir. Çok kısa bir kurutma süresi müteakip dehidrasyon adımları sırasında slaytların düşme bölümlere yol açar ve çok uzun bir kurutma süresi çatlama bölümlere yol açar. Bölümler hala kuruluk uygun düzeyde parlak olmasını görünecektir. </li><li> belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak, kresil moru ile Leke bölümleri. NOT: Bu isteğe bağlı adım kresil moru ile nöronal çekirdekleri leke amacıyla, dondurulmuş asla bölümler için kullanılabilir. Biz temizlenmesi ve kresil menekşe inkübasyon öncesi bölümler cildimizi hatta boyama ve bölümleri arasında düşük arka plan yol bulduk. <ol><li> 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li><li> su içinde, daha sonra su içinde% 95 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 50 etanol. </li><li> 5 dakika su içinde yerleştirin. </li><li> % 0.5 koyun CRE (w / v)7 dakika su içinde Syl mor. </li><li> 2 dakika için su içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak bölümleri kurutmak. <ol><li> su içinde, daha sonra su içinde% 50 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 95 etanol. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın. NOT: Bu dehidratasyon ve takas süreleri Bu yazıda anlatılan şekilde fare beyinleri işlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, son temizleme aşaması 15 dakika toplam kadar uzatılabilir gerekebilir, sıçan ve inek kuşu dahil olmak üzere diğer türler için gözlenmiştir. </li></ol></li><li> susuz bir montaj ortamı kullanılarak Lamel bölümleri. </li><li> slaytlar en az 5 gün süreyle karanlıkta oda sıcaklığında yatay kurumaya bırakın. </li></ol></li></ol> Kalın Beyin Bölümler içinde 2. Görüntüleme Vitray Nöronlar <ol><li> Görüntü Yığınları yakalama </strong&gt; <ol><li> Mikroskop ampul, kamera ve sahne kontrolörü açın. </li><li> Mikroskop yazılımı (örneğin Neurolucida) açın. </li><li> Mikroskop sahnede bir slayt yerleştirin. </li><li> Bu tür 1.25x 0.4 NA PlanAPO veya 4X 0.16 NA gibi düşük büyütme objektif kullanarak beyin kesitinin bir 2D geniş açılı görüntü yakalama <ol><li> Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma süresi ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın. </li><li> bölümünde herhangi bir yerinde sol tıklayarak bir referans noktası oluştur </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;tek görüntü elde&quot; seçerek görüntüyü yakalama. </li></ol></li><li> 10X 0.3 NA UPlan FL, N objektif kullanılarak, ilgi konusu nöronlar (ler) i ihtiva eden alanın orta çözünürlükte görüntü yığınları çeker. <ol><li> Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın. </li><li> Bölüm A üstüne odaklanarak görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlamand seçerek görüntü elde etme penceresinde &quot;yığının en üstüne&quot; yanında, sonra da bölümün altına odaklama ve görüntü elde etme penceresi içinde yanında &quot;alt yığının&quot; &quot;set&quot; seçerek &quot;set&quot;. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;görüntü arasındaki mesafeye&quot; nın yanındaki &quot;5 mikron&quot; girerek 5 um adım uzaklığını ayarlayın. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;acquire görüntü yığınını&quot; seçerek görüntü yığını yakalama. </li><li> Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> bir 30X 1.05 NA silikon yağ daldırma objektif kullanarak, ilgi konusu nöron içeren bölgenin yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları çeker. <ol><li> objektif ve oi ile ilişki kurmak için sağlanması, sürgünün silikon immersiyon 4 damla ve slayt üzerinde amacı yer - 3 uygulal. </li><li> Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın. </li><li> bölümün üstüne odaklanan ve &quot;set&quot; seçerek görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlayın sonraki ardından görüntü elde etme penceresi içinde ve &quot;yığının üst&quot; bölümünün altına odaklama ve seçmenin &quot;set&quot; görüntü elde etme penceresinde &quot;yığının altında&quot; yanında yer almaktadır. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;görüntü arasındaki mesafeye&quot; nın yanındaki &quot;1 mikron&quot; girerek 1 um adım uzaklığını ayarlayın. </li><li> görüntü elde etme penceresinde &quot;acquire görüntü yığınını&quot; seçerek görüntü yığını yakalama. </li><li> Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> veri dosyasını kaydedin ve dış işleme için TIFF formatında tüm resim dosyalarını kaydedin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Z-projeksiyon Görüntüleri ve Görüntü Montajları Oluşturma <ol><li> ImageJ Z-projeksiyon görüntüler oluşturun <ol><li> Biyo-Biçimleri eklentisi yüklü olan Açık ImageJ yazılımı. </li><li> &quot;Plugins&quot; Seç -&gt; &quot;Biyo-Biçimleri&quot; -&gt; &quot;Biyo-Biçimleri İthalatçı&quot;. </li><li> Görüntü yığını dosyasını seçin açılacak. </li><li> &gt; &quot;Tür&quot; - -&gt; &quot;RGB Renk&quot; dosya açıldığında, &quot;Resim&quot; i seçerek RGB&#39;ye biçimini değiştirmek. </li><li> &quot;Image&quot; seçeneğini seçerek Z-projeksiyon oluşturma -&gt; &quot;Yığınlar&quot; -&gt; &quot;Z Projesi ...&quot;. </li><li> TIFF dosyası olarak iki boyutlu Z-projeksiyon görüntüsünü kaydedin. </li></ol></li><li> bütün ilgilendiren alanın iki boyutlu görüntü montaj oluşturun. <ol><li> (Örneğin, Adobe Photoshop) yazılımını açın. </li><li> &quot;Dosya&quot; seçin -&gt; &quot;Otomatik&quot; -&gt; &quot;Photomerge&quot;. </li><li> Seç &quot;Gözat&quot; ve sonra tüm imag eklemekes dosyalar birleştirilecek. </li><li> &quot;Birlikte Görüntüleri Blend&quot; seçilirse ve ardından &quot;Tamam&quot; seçeneğini emin olun. </li><li> TIFF dosyası olarak ilgilenilen bölgenin tamamını çıkan montaj görüntüsünü kaydedin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://ppp.unipv.it/camillogolgi/pdf/Sullasostanza%20grigia.pdf">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li>
<li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF02954290">Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38(2016).</li>
<li>Levine, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+thin+tissue+Golgi-Cox+impregnation%3A+fast%2C+reliable+methods+for+multi-assay+analyses+in+rodent+and+non-human+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain.</a> J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).</li>
<li>Ranjan, A., Mallick, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+consistent+and+reliable+Golgi-Cox+staining+in+significantly+reduced+time%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time.</a> Front Neurosci. 1, 157(2010).</li>
<li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Narayanan, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraisal+of+the+effect+of+brain+impregnation+duration+on+neuronal+staining+and+morphology+in+a+modified+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method.</a> J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocampus+makes+a+significant+contribution+to+experience-dependent+neocortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity.</a> Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).</li>
<li>Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II%2FIII+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressive-like+behaviours+and+decreased+dendritic+branching+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+mice+with+tumors%3A+A+novel+validated+model+of+cancer-induced+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression.</a> Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).</li>
<li>Frauenknecht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+experimental+antiphospholipid+syndrome+display+hippocampal+dysfunction+and+a+reduction+of+dendritic+complexity+in+hippocampal+CA1+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).</li>
<li>Camacho-Abrego, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangement+of+the+dendritic+morphology+of+the+neurons+from+prefrontal+cortex+and+hippocampus+after+subthalamic+lesion+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats.</a> Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).</li>
<li>Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li>
<li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li>
<li>Lytton, W. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLytton%2C+WW+%22From+computer+to+brain+%3A+foundations+of+computational+neuroscience%22">From computer to brain : foundations of computational neuroscience</a>. , Springer. (2002).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd, Academic. (2001).</li>
<li>Ha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi-Cox+method+with+counterstain+for+the+study+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses.</a> Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+coeruleus%3A+a+cytoarchitectonic%2C+Golgi+and+immunohistochemical+study+in+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat.</a> Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).</li>
<li>Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+combining+Golgi+and+Nissl+staining+to+study+neuronal+morphology+and+cytoarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Biz kalın beyin bölümlerinde nöronların görselleştirilmesi için burada Golgi-Cox boyama protokolü iki yararlı varyantları ile birlikte açıklar. Temsili Sonuçlar gösterildiği gibi, uzun bir 800 mikron çalışma mesafesine sahip yüksek çözünürlüklü hedefi kullanımı 500 um kesilerek beyin bölümlerinin derinliği boyunca tüm nöronların güvenilir olarak gösterebilir. nispeten kalın beyin kesitlerinin Bu çalışma, her tür lekeli nöronlar olarak uzun ve karmaşık apikal dendrit ağaçlar piramidal nöronlar için özellikle önemlidir di...

Doku örnekleri içindeki tek tek nöronların görselleştirme beynin anlaşılmasını önemli ölçüde ve endojen hastalık veya eksojen çevresel faktörlerden etkilenebilir nasıl nöron morfolojik özelliklerinin yerinde analizi için izin verir. Golgi Cox boyama yöntemi beyin içindeki nöronların rasgele örnek boyama bir düşük maliyetli, nispeten basit bir yöntemdir. İlk 1800&#39;lerde Golgi 1 tarafından geliştirilen ve Cox 2 modifiye araştırmacılar ayrıca, görselleştirmek ve dendritik bitkilerin morfolojik ve omurga yoğunluğu 3, 4, hem ölçmek için kullanılabilecek net, iyi boyanmış nöronlar üretmek için yılda bu tekniği rafine 5, 6, 7, 8, 9. beyin bölümlerinde boyanan nöronların görüntülenmesi için önemli bir teknik göz mevcut olan, yüksek büyütme / yüksek çözünürlüklü mikroskop hedeflerin çalışma mesafesi ile sınırlıdır, maksimum kesit kalınlığı vardır. 60 ortak yağ daldırma amaçlar - 100X mükemmel çözünürlük temin aralığı, fakat tipik olarak 200 um daha büyük olan çalışma mesafesi ile sınırlıdır. 200 um aralığında kesilmiş beyin kesitleri serebral korteks 10, CA1 bölgesindeki 11, 12, piramidal nöronlar sığ tabakalarda, örneğin piramit nöronlar için bu dilim kalınlığı içinde ihtiva edilebilir bazı nöron türleri, görselleştirmek için yeterli olabilir hipokampus 15 dentat girus hipokampus 13, 14, ve granül hücreleri. Nispeten uzun olan NöronlarBu tür beyinler bütün dendrit ağaç içeren bir mükemmel bir açıyla kesitli olması gerekir, çünkü hücre gövdesi 16 &#39;den fazla 800 um uzanabilir fare için, daha büyük bir meydan okuma sağlayan serebral korteksin derin katmanlannda içinde piramidal nöronlar gibi dendritik ağaçlar, 200 um dilimleri içinde. dendrit ya da dallarından herhangi rostral veya kaudal yönde uzanan, bu da mümkün olmayabilir. Birden çok bitişik beyin bölümleri arasında bir nöron takip ederek bu sınırlamayı ele almak mümkün olsa da, bu yaklaşım 17 izleme için doğru bölümlerini ayarlamak önemli bir teknik sorun tanıtır. Daha pratik bir yaklaşım, daha büyük bir kalınlıkta kesilir beyin kesitleri içinde bulunan tüm nöronlar görselleştirmek için olacaktır. Golgi Cox yöntemi kullanılarak farelerin 500 um kalınlığında beyin bölümleri ve bunların mo görselleştirmek için - Burada 400 içindeki nöronlar leke bir teknik raporrphology 800 um çalışma mesafesine sahip bir yüksek çözünürlüklü silikon yağ daldırma objektif kullanarak. Bizim tarif Golgi Cox emdirme ve işleme protokol literatürde 6&#39;da en çok atıf modern protokoller birinden modifiye edilir. Kalın beyin kesitleri ile Yaklaşımımız tam bölüm içinde yer alan herhangi bir tipte nöronları belirlenmesi ihtimalini arttırmaya yönelik bir avantaj sağlar. Ana protokole ek olarak, aynı zamanda eşsiz yararlar sağlar, bu iki varyasyon: sırayla monte kesitlerin yüzeyi üzerinde kresil menekşe karşıt (1) Golgi Cox boyama beyin bölgelerinin sınırları tayin ve tabakalarını tanımlamak için kesit ve son işlem öncesi emdirilmiş tüm beyinlerinden uzun süreli depolama için bir ara dondurma adımı ile serebral korteks, ve (2) Golgi Cox boyama.

<table><tbody><tr><td>potasyum dikromat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P188-100</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>potasyum kromat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P220-100</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>cıva klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25423</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Whatman derece 1 filtre kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Kanada'nın İlaç Ortakları</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>20 mL sintilasyon şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Bioshop Canada</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5011-500G</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390-500G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>izopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC126470010</td><td>2-metilbütan olarak da bilinir; tehlikeli</td></tr><tr><td>agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-100G</td><td></td></tr><tr><td>küçük tartı kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1b</td><td></td></tr><tr><td>ağ tabanlı doku kültürü ekleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-214</td><td></td></tr><tr><td>paraformadelhyde (PFA), %16</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710-S</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>amonyum hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Kodak Sabitleyici A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7542</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>CitroSolv temizleme maddesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>susuz etil alkol</td><td>Ticari Alkoller</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>kresil menekşe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1791</td><td></td></tr><tr><td>permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX53 modeli</td><td></td></tr><tr><td>renkli kamera, 12 bit</td><td>MBF Biosciences</td><td>DV-47d</td><td>QImaging parçası 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td></tr><tr><td>3D motorlu mikroskop tablası, kontrolör ve enoderler</td><td>MBF Biosciences</td><td>N/A</td><td>MBF Biosciences</td></tr><tr><td>4X mikroskop objektifi</td><td>Olympus</td><td>4x 0.16 N.A. UplanSApo</td><td></td></tr><tr><td>10X mikroskop objektifi</td><td>Olympus</td><td>10x 0.3 N.A. UPlan FL N&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30X mikroskop objektifi</td><td>Olympus</td><td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60X mikroskop objektifi</td><td>Olympus</td><td>60x 1.42 NA PlanAPO N</td><td></td></tr><tr><td>silikon daldırma yağı</td><td>Olympus</td><td>Z-81114</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida yazılımı</td><td>MBF Biosciences</td><td>Sürüm 10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>Geçerli sürüm</td><td>OME Bio-Formats eklentisi yüklü Photoshop</td></tr><tr><td>yazılımı</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td></td> sürümü</tr></tbody></table>

golgi-cox yöntemiyle kalın beyin bölümler içinde görüntüleme nöronlar

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

nöron boyama Golgi-Cox yöntemi histolojik beyin numuneleri içinde nöron morfolojisi anlayışımızı ilerletmek için fazla iki yüz yıldan kullanılmıştır. tam olarak tek bir bölüm içinde bulunan lekeli nöronların tanımlama olasılığını arttırmak amacıyla, mümkün olan en büyük kalınlıkta beyin kesitler hazırlamak için pratik bir bakış açısından tercih edilir olsa da, bu yaklaşım, yüksek çalışma mesafesi ile teknik açıdan sınırlıdır -magnification mikroskop amaçları. Burada 500 um kalınlığında kesilir fare beyin bölümlerinde, Golgi-Cox yöntemiyle nöronlar leke ve yüksek çözünürlüklü 30X 1.05 NA silikon ile donatılmış dik bir mikroskop kullanarak bu bölümlerin derinliği boyunca nöronlar görselleştirmek için bir protokol rapor 800 um çalışma mesafesine sahip yağ daldırma objektif. Ayrıca yüzeyini counterstain için kullanılabilir bu protokolün iki faydalı varyantları raporkresil violet Nissl leke beyin bölümleri monte edilebilir veya önceden kesit ve son işlem uzun süreli depolama için bütün beyin dondurma. Ana protokolü ve iki varyantları, tam nöron dendritik ağaçları ve dendrit dikenleri güvenilir görüntülenmiştir ve sayısal edilebilen boyunca lekeli kalın beyin bölümleri üretir.

500 um kalınlığında beyin kesitleri - Bu Golgi Cox boyama protokolü ve iki tarif edilen isteğe bağlı varyantları 400 içindeki tek tek nöronlar görselleştirmek için kullanılabilmektedir. 10X objektif ve Z ekseninde 5 um adımlar kullanılarak çekilen iki boyutlu Z çıkıntıların Örnek görüntü montajları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir: A1 - ön singulat kortekste alanı 1 ve şunları içerir koronal beyin kesitleri büyük bir alan için C1- İkinci motor korteks <su...

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen beynindeki nöronların morfolojisi üzerindeki etkili tedaviyi belirlemektir. Bu yöntem, kemirgen beyninin çeşitli bölgelerindeki nöronların normal ve deneysel olarak manipüle edilmiş morfolojisi gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil histolojik örnekler içerisinde tamamen yer alan işaretli nöronların tanımlanma ve görselleştirilme olasılığını artırmasıdır.Taze bir fare beynini 17 mL Golgi-Cox çözeltisi içeren 20 mililitrelik cam sintilasyon şişesine yerleştirerek Golgi-Cox boyamasına başlayın. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 25 gün boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduğunda, beyni 40 mL sükroz kriyoprotektan içerisine yerleştirerek kriyoproteksiyon işlemini gerçekleştirin ve 4 °C'de karanlıkta 24 saat boyunca inkübe edin.Sükroz içindeki inkübasyondan sonra beyin, uzun süreli saklama için dondurulabilir veya videonun bir sonraki bölümünde gösterildiği gibi kesit alma işlemi için hemen bloke edilebilir. Dondurma işlemi yapılacaksa, tüm beyni kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş 200 milliliters isopentan içine daldırın. Ardından, donmuş beyni 50 milliliter konik tüpe ye

imaging-neurons-within-thick-brain-sections-using-the-golgi-cox-method

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, bir sıçan hipokampal bölümünde biyositin dolu bir internöronun görselleştirilmesi sürecini göstermekte ve spesifik antikorlar ve floresan mikroskobu kullanılarak nörokimyasal kimliğini vurgulamaktadır.

Sıçan hipokampal bölümünde internöronların immün boyanması

Kaynak: Louth, E. L.,  et al. Golgi-Cox yöntemini kullanarak kalın beyin bölümlerindeki nöronları görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, üst ve alt odak sınırlarını ayarlayarak ve üst üste binen görüntüleri yakalayarak Golgi-Cox lekeli kalın bir beyin bölümündeki nöronları görüntülemeyi göstermektedir. Ayrıntılı nöronal projeksiyonları sağlamak için birden fazla konum görüntülenir ve bunlar bir 3D temsil oluşturmak için birleştirilir.

Golgi-Cox Metalik Boyama Kullanılarak Bir Fare Beyin Bölümündeki Nöronların Mikroskobik Görüntülenmesi

Bu kağıt sıçan yavrularının dokunsal uyarım ve nöronal morfoloji sonraki Golgi-Cox boyama işlemleri anlatılmaktadır. Dokunsal uyarım bir ev silgi ile yavrular okşayarak tarafından perinatal dönemde uygulanır olumlu bir deneyim olduğunu. Golgi-cox boyama tüm nöronların görüntülenmesine olanak güvenilir bir işlemdir.

Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir.

Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.

Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Öğrenin kalın beyin kesitlerinde Golgi-Cox boyama yöntemiyle uzun dendritik ağaçlara sahip nöronları görüntülemeyi. Bu teknik, fare beynindeki nöron morfolojisini incelemek için kullanılır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Daha fazla video keşfet