تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

الهدف العام لهذه الطريقة هو التحليل المتوازي عالي الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية متعددة الأعضاء في البيئات المحصورة باستخدام مصفوفات آبار السيليكون الصغيرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفحص متوازي عالي الإنتاجية للتفاعلات الميكروبية الموضعية بدقة والتي تعتبر مهمة للصناعة والطب والبيئة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الطب الحيوي والبيئة الميكروبية مثل كيف تقود القيود المكانية المتأصلة على المقاييس الدقيقة المعلمات الحتمية والعشوائية لتنمية المجتمع وما هي التأثيرات الرئيسية على وفرة الأعضاء الميكروبيين وتنظيمهم؟

ابدأ بإعداد مصفوفات الآبار الصغيرة. أولا ، قم بقص رقائق مصفوفة الآبار الدقيقة الفردية من رقائق السيليكون المطبوعة بمصفوفات متعددة باستخدام كاتب الماس. تحتوي كل شريحة فردية على مصفوفات فرعية من الآبار بأقطار تتراوح من خمسة إلى 100 ميكرون بثلاث كثافات تباعد مختلفة.

على كل شريحة ، يتم أيضا تكرار الشكل الكامل للآبار أربع مرات. بعد ذلك ، قم بعمل غرفة مرطبة باستخدام صندوق طرف ماصة ومنديل مبلل ب PBS. ثم ضع قطرة 150 ميكرولتر من محلول BSA على كل شريحة واحتضان الرقائق في الصندوق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

في غضون ذلك تحضير البكتيريا. قم بتدوير المزرعة وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من وسط R2A الطازج مع اثنين بالمائة من الجلسرين. ثم قم بقياس كثافة الثقافة عند 600 نانومتر واضبط التركيز على كثافة بصرية تبلغ 0.02.

بعد حضانة الرقاقة ، قم بإزالة محلول BSA وشطف الرقائق ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد الشطف ، جفف الرقائق بغاز النيتروجين وأعيدها إلى الغرفة المرطبة. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من تعليق الثقافة إلى كل شريحة جافة واحتضان الرقائق لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية حتى يكون لدى البكتيريا الوقت للالتصاق بالآبار ، لكن الانقسام الخلوي لأي تلوث محتمل يكون بطيئا.

لتحضير شريحة للتصوير ، قم أولا بعمل زلة غطاء مطلية بالأغروز لكل شريحة. قم بتسييل كمية صغيرة من الاغاروز ، هناك حاجة إلى حوالي خمسة ملليلتر لكل زلة غطاء. بعد ذلك ، اغسل جانبا واحدا من زلة الغطاء بالإيثانول وقم بتوسيطه على شريحة زجاجية مع الجانب المغسول لأعلى.

ثم ضع فواصل PDMS بسمك ملليمتر واحد على طول الحواف الطويلة لانزلاق الغطاء وقم بتحويل زلة الغطاء بحيث يتدلى ملليمتر واحد من الشريحة. الآن ، صب ما يكفي من الاغاروز على زلة الغطاء لتغطيتها بالكامل. ثم استخدم شريحة زجاجية ثانية لتسطيح الاغاروز إلى سمك موحد.

قم بإعداد العديد من مجموعات الشرائح هذه بالتوازي. عندما يبدأ الاغاروز في التصلب ، انقل التجميعات إلى أربع درجات مئوية. بعد 15 دقيقة من التبريد ، قم بقص الأغروز الزائد حول زلات الغطاء.

ثم ضع التجميعات في أطباق بتري وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. بعد أن تحتضن الرقائق مع البكتيريا ، اغمس الرقائق في ماء نقي للغاية واحدة تلو الأخرى لمدة 10 ثوان لكل منها. ثم ضع الرقائق المبللة على حوافها فوق منديل حتى يجف معظم السائل.

الآن ، قم بإزالة البكتيريا التي لم تستقر في الآبار. قم بقص قطعة من الشريط بطول شريحة السيليكون وألصقها بطبقة الباريلين على السيليكون. ثم انزع الشريط لإزالة طبقة الباريلين واستعد على الفور لقلب الشريحة.

الآن ، ضع الرقاقة على مجموعة شرائح بحيث تكون الآبار الصغيرة على اتصال مع الاغاروز. احرص على عدم تحريك أو تحريك الرقاقة بمجرد ملامستها للأغروز. الآن ، انقل التجميع الكامل إلى حامل الشريحة لغرفة التحكم البيئي في سطح المسرح واحصل على صور بفاصل زمني خلال ال 24 ساعة القادمة في الفاصل الزمني المطلوب وأقل من تكبير 10x.

قم بمعالجة مجموعات الصور باستخدام البرامج التقليدية المتاحة مجانا. أولا ، قم باستيراد تسلسل الصورة. للحساب المتوسط، قم بتحميل صور التصحيح أو الحقل المظلم.

ثم قم بإجراء طرح الخلفية. قم بتوفير قيمة نصف قطرها مثل 135 بكسل وحدد القطع المكافئ المنزلق. بعد ذلك ، قم بإزالة متوسط صورة المجال المظلم من صورة حقل الإضاءة المتوسط عن طريق تحديد الصورتين واستخدام عملية الطرح.

الآن ، قم بتطبيق تصحيح الإضاءة على النحو التالي. اضبط العملية على القسمة ، واضبط i1 على صورة البئر ، واضبط i2 على صورة التصحيح ، واضبط k1 على متوسط صورة التصحيح ، واضبط k2 على الصفر. ثم انقر فوق إنشاء نافذة جديدة.

لتحديد نمو البكتيريا في الآبار الصغيرة ، حدد أولا المناطق ذات الأهمية باستخدام قابس المصفوفة الصغيرة. في قائمة الخريطة ، انقر فوق إعادة تعيين الشبكة وحدد الصفوف والأعمدة وأقطار البئر. ثم من قائمة شكل عائد الاستثمار، حدد دائرة.

لضبط مصفوفة عائد الاستثمار على الصورة، يمكن نقل مصفوفة عائد الاستثمار بالضغط على مفتاح ALT أو ALT+SHIFT وتحديد عائد الاستثمار العلوي الأيسر بالماوس. لتغيير حجم عائد الاستثمار، اضغط على مفتاح shift أثناء تحديد الجزء السفلي الأيمن من مصفوفة عائد الاستثمار. لضبط التباعد بين عائد الاستثمار، اضغط على مفتاح shift أثناء سحب الجانب العلوي أو السفلي من المصفوفة.

بمجرد أن تتلاءم مصفوفة عائد الاستثمار مع آبار الصورة، انقر فوق قياس RT. ثم سيتم إخراج جدول يحتوي على جميع القياسات لكل صورة أو نقطة زمنية ويمكن نسخه في جدول بيانات لتحليله. تمت مقارنة نمو سلالتين من Pseudomonas aeruginosa. تعبر سلالة واحدة بشكل أساسي عن بروتينات المستجيب السامة المرتبطة بإفرازات النوع السادس.

والآخر عرضة للإصابة بالتسبب في النوع السادس بسبب فقدان الوظيفة. كلاهما يعبر عن بروتين فلوري مختلف. تمت دراسة الثقافات المشتركة طوليا وبأحجام مختلفة من الآبار.

تم استزراع البكتيريا بشكل فردي وكثقافة مشتركة. تم تصوير 20 ساعة من النمو على فترات 30 دقيقة. بعد إجراء تصحيحات البرامج على بيانات التصوير ، تم رسم مسارات النمو الكمي.

في الثقافة المشتركة ، لا تشير البيانات إلى الكثير من التغيير في النمو. للمضي قدما في التحليل ، تم تركيب كل مسار لوظيفة لوجستية معدلة بثلاث معلمات ، الحد الأقصى للإشارة ، والحد الأقصى للمعدل ، ووقت التأخير. يشير هذا التحليل إلى أن الاستزراع المشترك لهذه الأنواع كان له تأثير ضئيل على نموها الكلي وأن تنوعها الذي شوهد في منحنيات النمو يرجع على الأرجح إلى العوامل البيئية.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ الإعداد في غضون ساعات قليلة إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك خلايا تنمو بقوة لضبط قيم OD النهائية للخلية بشكل صحيح للحصول على طبقات مثقاب موحدة في تجميعات الرقائق وأن تكون متيقظا أثناء خطوة تقشير الباريلين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن معالجة أسئلة مثل كيف يتغير التعبير الجيني داخل كل مجتمع كدالة لتكوين المجتمع وتنظيمه ، عن طريق تحليل المواد الجينية.

لا تنس أن العمل مع Pseudomonas aeruginosa يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل القفازات والسترة والنظارات الواقية وتقنيات التعقيم المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.