Name: Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Lernen Sie ein neues Vesikel-Isolationsprotokoll zur Aufreinigung membranöser Kompartimente für ERAD-vermittelten Abbau exogener Antigene in der Kreuzpräsentation. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in immunologische Prozesse.

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Diese Arbeit wird von der Takasaki Hochschule für Gesundheit und Soziales unterstützt.

1. wachsenden Zellen und Ergänzung der exogene Antigene <ol><li>Prepare bOVA mit einem Biotin-Protein-Kennzeichnung kit nach dem Hersteller &#39; s Protokoll. 
	Hinweis: Normalerweise bOVA enthält 2 M Biotin pro 1 M OVA durchschnittlich.</li>
	<li>Wachsen DC2.4 Zellen RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 55 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) und 10 % fetalen Kälberserum (im folgenden RPMI) bei 37 ° C in 5 % CO 2 in einem befeuchteten Inkubator (im folgenden ohne Erwähnung, Zellen sind inkubiert in diesem Zustand). Es ist auch möglich, verwenden Sie DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum, 3,7 g/L Nahco3 3 (im folgenden DMEM) anstelle von RPMI ergänzt.</li>
	<li>Einen Tag vor der Reinigung, die Zellen in RPMI bis 1 x 10 5 Zellen/mL in einer Gewebekultur Platte aufgeteilt. Vermeiden Sie die Zellen an einem konfluierende Zustand zu halten. DC2.4 Zellen können exogene Antigene hoch bis semi-konfluierende Zustand zu übernehmen, aber schnell verlieren die Fähigkeit nach einer übermäßigen Zusammenfluss Zustand zu erreichen.</li>
	<li>Vor der DC2.4 Zellen sind semi-konfluierende, fügen Sie 250 µg/mL bOVA für 1 x 10 6 Zellen/mL und inkubieren Sie für 2-4 h 
	Hinweis: Während der nachfolgenden Experimente alle Puffer und Reagenzien sind gehalten bei 4 ° C sofern nicht anders angegeben.</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Microsomen <ol><li>die DC2.4 Zellen durch sanfte Pipettieren von der Gewebe-Platte in ein neues 50 mL konische Röhrchen ernten.</li>
	<li>Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C und entfernen Sie vorsichtig das Medium mit bOVA durch Aspiration.</li>
	<li>Die DC2.4 Zellen zweimal mit 40 mL PBS-Puffer (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands jedesmal durch Absaugen.</li>
	<li>Aufschwemmen das Pellet in Schritt 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 Volumen Kulturmedium) Homogenisierung Medium (0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails und Übertragung der resuspendierte DC2.4 Zellen in einer eiskalte Dounce-Homogenisator.</li>
	<li>Stören die resuspendierte DC2.4 Zellen sanft von 10-20 Schläge mit dem eiskalten Dounce-Homogenisator. 
	Hinweis: Während der Unterbrechung Schritt Dounce-Homogenisator wird gekühlt auf Eis</li>
	<li>Übertragen die Zelle gestört Aussetzung zu einem neuen 15 mL konische Schlauch.</li>
	<li>10 mL insgesamt 8-9 mL Homogenisierung Medium hinzu und Zentrifugieren die konische Röhre für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Übertragen den Überstand auf eine neue 15 mL konische Rohr, ungebrochene Zellen und Kerne entfernen und Zentrifugieren die konische Röhre wieder für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Übertragen den Überstand in ein neues Ultrazentrifugation Rohr und Zentrifuge für 45 Minuten bei 100.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Pellet sorgfältig in 1-2 mL Homogenisierung Medium mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals in Sekundenbruchteilen Microsome für nachgeschaltete Experimente machen.</li>
	<li>Übertragen die Microsome Bruchteil in ein neues Röhrchen 5 mL Rundboden. 
	Hinweis: Nach diesem Schritt ist es möglich, Objektive Microsomen durch Iodixanol Dichte Gradienten Zentrifugation laut Hersteller bereichern &#39; s-Protokoll, um unspezifische Microsomen zu entfernen. Die Peak-Fraktionen für exogene Antigene werden gesammelt und dann mit dem nächsten Schritt der Reinigung (Schritt 3) unterworfen.</li>
</ol> 3. Reinigung von Microsomen mit bOVA unterziehen ERAD <ol><li>Add 1/100 Volumen von frischen SA-magnetischen Kügelchen auf den Microsome Bruchteil Schritt 2.11 in der 5 mL Runde Unterrohr. 
	Hinweis: Bevor Sie diesen Schritt, es ist möglich, Microsome Bruchteil von Kontrolle-magnetische Beads zu Verunreinigungen der unspezifischen Microsomen vorab klar.</li>
	<li>Sanft vermischen und drehen die Rundboden-Röhre langsam für 30 min bei 4 ° c</li>
	<li>Insgesamt 4 mL in die Rundboden Röhrchen ca. 2-3 mL Homogenisierung Medium hinzufügen und vorsichtig vermengen.</li>
	<li>Ein Magnetstativ Rundboden Rohr aufsetzen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Da die Perlen an die Vesikel gebunden der Magnet angezogen sind, braune Mikro-Perlen werden allmählich reichern sich an der Rohrwand am nächsten an den Magneten.</li>
	<li>Mit dem Rohr in der Magnetstativ verbleibenden sorgfältig verwerfen die Überstände durch Absaugen, die ungebundenen Vesikel zu entfernen.</li>
	<li>Waschen die magnetische Beads die Vesikel zweimal mit 5 mL Medium Homogenisierung durch die magnetische verpflichtet stehen für 10 min bei 4 ° C und entsorgen des Überstands jedesmal durch sorgfältig absaugen. 
	Hinweis: Ohne Magnetstativ, Reinigung von Centrifugations bei 2.000 x g für 10 min, 4 ° C ist auch verfügbar.</li>
	<li>Aufschwemmen der magnetischen Kügelchen durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals an die Vesikel sorgfältig in 100 µL Homogenisierung Medium gebunden.</li>
	<li>Übertragen die resuspendierte Vesikel in eine neue Reaktionscup als die gereinigten Microsome für nachgeschaltete Experimente. 
	Hinweis: In der Regel 50 µL Microsome Bruch mit 5-20 µg Proteinen aus 1 x 10 7 Zellen isoliert werden kann.</li>
</ol> 4. Analyse der gereinigt Microsomen <ol><li>Aufschwemmen der magnetischen Perlen verpflichtet die Vesikel aus Schritt 3,8 für 100-200 µL Puffer TNE (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 % Nonidet p-40) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails anstelle der Homogenisierung Medium.</li>
	<li>Übertragen die lysate aus Schritt 4.1 auf eine neue 1,5-mL-Reaktionscup.</li>
	<li>Bestimmen die Proteinkonzentration Schritt 4.2 mithilfe einer BCA Assay Kit pro Hersteller &#39; s Protokoll. 
	Hinweis: In der Regel 5-10 µL lysate aus Schritt 4.2 genügt, um festzustellen, die Proteinkonzentration.</li>
	<li>Übertragen die lysate aus Schritt 4.2 (2 µg Protein für silberne Färbung und 10 µg Protein für das westliche Beflecken) in neue Mikroröhrchen.</li>
	<li>Setzen die Mikroröhrchen auf einem Heizblock bei 95 ° C und Kochen Proteine in 1 x SDS-Gel-laden-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM Dithiothreitol, 4 % SDS, 0,2 % Bromophenol Blue, 20 % Glycerin) für 5 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Mikroröhrchen für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in neue Mikroröhrchen die unlöslichen Anteile entfernen.</li>
	<li>Die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (2 µg) von standard SD-Seite zu analysieren.</li>
	<li>Visualisieren die Protein-Bands durch die silberne Färbung mit silbernen Färbung nach dem Hersteller Kit &#39; s Protokoll.</li>
	<li>Analysieren die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (10 µg) von standard SD-PAGE und Western-Blot. Verwenden Sie das Reagenz (SA-HRP) pro Hersteller &#39; s-Protokoll und visualisieren von Fluorography.</li>
</ol> 5. In-vitro- Rekonstitution des ERAD Ubiquitination von bOVA Verwendung gereinigt Microsomen <ol><li>Übertragung der gereinigten Microsomen (5-10 µg Protein) von 3,8 Schritt mit einem Volumen von 50 % der Retikulozytenzahl lysate (RL), 1 x Reaktion Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl (2), und 12:02-Flag gekennzeichnet Ubiquitin in eine neue Reaktionscup. Der letzte Band dieses Experiments ist 20-40 µL.</li>
	<li>Inkubation die Reaktionscup für 2 h bei 37 ° c 
	Hinweis: Wenn die Menge an Ubiquitinated bOVA in Schritt 5.12 zu klein, durch westliche Beflecken zu erkennen ist, fügen Sie 10 µM MG132 oder 2 µM Lactacystin, die Verarbeitung von Ubiquitinated bOVA durch Proteasomen hemmen.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion indem man die Reaktionscup auf Eis.</li>
	<li>Lösen die Microsomen durch Zugabe von 500 µL TNE Puffer mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails.</li>
	<li>Die Reaktionscup Zentrifuge für 10 min bei 21,500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in eine neue Reaktionscup die unlöslichen Brüche zu entfernen, die Ubiquitinated bOVA in DC2.4 vor der in-vitro- Ubiquitination Assay enthalten.</li>
	<li>Den Überstand auf eine neue Reaktionscup übertragen und Volumen 1/100 der neuen SA-magnetische Beads (in der Regel 5 µL für 500 µL Überstände).</li>
	<li>Sanft vermischen und drehen die Reaktionscup langsam für 30 min bei 4 ° c</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen der Überstand durch Absaugen, bOVA und Ubiquitinated bOVA wiederherzustellen mit der SA-magnetische Beads gebunden.</li>
	<li>Waschen zweimal die gesammelten SA-magnetische Beads mit 1 mL TNE Puffer durch Zentrifugation für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen des Überstands jedesmal durch Aspiration.</li>
	<li>Kochen der SA-magnetischen Kügelchen in 1 x SDS-Gel Ladepuffer für 5 min bei 95 ° C auf einem Hitze-Block, der gereinigten Proteine durch die SA-magnetische Beads zu lösen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° c in eine neue Reaktionscup, die unlöslichen Anteile zu entfernen die Überstände sammeln.</li>
	<li>Analysieren die SA-magnetische Beads durch standard SD-Seite und Western-Blot-an die Proteine gebunden. Der Einsatz von Antikörpern (Anti-Flag, Anti-Multi-Ub und Anti-Maus IgG-HRP) und das Reagenz (SA-HRP) ist pro Hersteller &#39; s-Protokoll und visualisiert durch Fluorography.</li>
</ol>

<ol><li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li>
<li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+C+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).</li>
<li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li>
<li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li>
<li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN%2FCD209%28%2B%29+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li>
<li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li>
<li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8%2B+dendritic+cell+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li>
<li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li>
<li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8%2B+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li>
<li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li>
<li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+%28ERAD%29+in+cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li>
<li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li>
<li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li>
<li>Lizée, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li>
<li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li>
<li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity%2C+contradictions%2C+and+conundrums%3A+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li>
<li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li>
<li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li>
<li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li>
<li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li>
<li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li>
<li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li>
<li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761306004262">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li>
<li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li>
<li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li>
<li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In früheren Studien von CP eingearbeitete exogene Antigene in den geschützten Bereich des späten Endosom oder ER durch immunofluorescent Mikroskopie16,30,31,32angesammelt. Es wird geschätzt, dass ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen in diesen spezialisierten Bereichen ER oder späten Endosom durchgeführt werden, wie das zelluläre Fach von Saccharose oder Iodixanol Dichte Gr...

Die MHC ich Moleküle auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen, mit kurzen Antigene Peptide abgeleitet endogene Antigene, die durch das Ubiquitin-Proteasom-System in der Zellflüssigkeit1verarbeitet werden ausgedrückt werden. Nach der Bearbeitung werden Antigene Peptide in das endoplasmatische Retikulum (ER)-Lumen von Peptid-Transporter TAP transportiert. Das ER-Lumen eine Reihe von spezifischen Chaperone unterstützen das Peptid-laden und die korrekte Faltung des MHC ich komplexe. Diese Reihe von Molekülen nennt man die Peptid-laden-Komplex (PLC), darauf hinweist, dass ER ein zentrales Fach für Peptid laden auf MHC ich2. Nach Peptid laden, MHC ich Moleküle an der Zelloberfläche transportiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der adaptiven Immunsystems als selbständige Marker und ermöglicht die CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), Krebszellen oder Krankheitserreger erkennen von Antigenen Peptide aus Nichtselbst Proteine3.
Antigenpräsentierende Zellen (APC), Antigene Peptide aus exogene Antigene sind auch auf MHC habe ich4,5,6,7,8 über CP, das hauptsächlich getragen wird vorgestellt von DCs9,10,11. CP ist wichtig sowohl für die Aktivierung von naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen gegen Infektionen und Anti-Tumor CTLs12,13, und bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz durch die Inaktivierung der selbsttätige naive T-Zellen14,15. Der CP spielt viele wichtige Rollen in das adaptive Immunsystem jedoch die molekularen Mechanismen der CP müssen noch im Detail beschrieben werden. Frühere Studien der CP ergab, dass exogene Antigene, in der ER und das Endosom lokalisiert wurden und wurden von ERAD, was darauf hindeutet, dass exogene Antigene, die ER für ERAD-wie Verarbeitung und laden16 Peptid aus dem Endosom transportiert werden verarbeitet . Sammeln Beweise deutet jedoch darauf hin, dass das Peptid-Laden von CP durchgeführt wird, nicht in der Notaufnahme sondern im nicht-klassischen endocytic Fächer, die auch Besonderheiten der ER (Abbildung 1)17,18 ,19,20,21. Zur Vermeidung von Abbau der Antigen Peptid Vorläufer von der hohen Aktivität des Aminopeptidase tritt22 im Zytosol, Verarbeitung und Peptid im CP laden im proximalen Bereich dieser nichtklassischen endocytic Abteilungen (Abbildung 1). Obwohl die Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen umstritten sind, gibt es keine bestehende spezifische Moleküle als exogene Antigene in diesem Fach.
ERAD ist ein zellulärer Weg, der speziell fehlgefaltete Proteine aus dem ER entfernt. In dem ERAD Weg fehlgefaltete Proteine Doppelthebel durch die ER-Membran, das Zytoplasma transportiert und verarbeitet von den Ubiquitin-Proteasom System23,24,25. Beim Transport von großer Molekülen wie Proteinen, durch die Lipid-Bilayer durchlaufen diese Moleküle ein molekularer Apparat namens ein Translocon, wie der Sec61 komplex und Delrin Komplex in die ER26, und die komplexe Tom und Tim Komplex in der Mitochondrien-27. Wenn exogen hinzugefügt Antigene durch die ER-Membran transportiert werden, müssen sie die Lipid-Bilayer im Komplex mit Translocons, wie den Sec61-Komplex eindringen. Die hier beschriebene Methode gereinigt die gezielte Blase durch die Nutzung dieser Membran durchdringen Moleküle als Marker für die endocytic Fächer.
Die hier beschriebene Methode ist ein neues Vesikel-Reinigung-Protokoll mit der DC-ähnliche Zelle Zeile DC2.428 und biotinylierte Ovalbumin (bOVA) als eine exogene Antigen. Die endocytic Fächer wurden gereinigt, indem Streptavidin (SA)-magnetische Beads, die mit der Membran durchdringen bOVA als Hersteller. In diesem gereinigten Microsome hinzugefügt einige exogen bOVA blieb noch in Bruchteilen Membran aber waren an der Außenseite des Microsome und dann Ubiquitinated transportiert und verarbeitet in-vitro-29. Dieses gereinigte Microsome enthielt nicht nur endocytic Fach-spezifische Proteine, sondern auch ER ansässigen Proteine für ERAD und das Peptid Komplex laden; darauf hindeutet, dass das zelluläre Fach das prospektive endocytic Fach für CP29. Dieses Protokoll ist nicht abhängig von der Art der exogene Antigene und gilt auch für andere DC-Subsets und andere Zelltypen, z. B. Endothelzellen, Makrophagen und B-Zellen, den genaue molekularen Mechanismus der DCs für kompetente CP zu klären.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco von life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>gibco von life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>gibco von life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco von life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco von life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>gibco von life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penisicillin-Sreptomycin</td><td>gibco von life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco von life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-Protein Etikettierkit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktails</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-magnetische Kügelchen</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolle magnetische Kügelchen</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>magnetisches Gestell</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Silberfärbekits</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Retikulozyten Lysat</td><td>Promega</td><td></td><td></td>1730714</tr><tr><td>Flaggenmarkiertes Ubiquitin</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ovalbumin (OVA,Maus)</td><td>Antikörper Shop</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>Ant-Multi-Ubiquitin (Maus)</td><td>MBL</td><td>D058&minus; </td><td></td>3</tr><tr><td>Anti-Flag (Maus)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung der membran-fach für endoplasmatische retikulum-assoziierten abbau von exogenen antigenen in kreuz-präsentation

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritische Zellen (DCs) sind leistungsfähige Verarbeitung und verinnerlichten exogene Antigene auf großen Histocompatibility-Klasse (MHC) zu präsentieren ich Moleküle auch bekannt als Kreuz-Präsentation (CP). CP spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Stimulation der naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen für infektiöse und Tumor Immunität sondern auch bei der Inaktivierung von selbsttätige naive T-Zellen durch T-Zell-Anergie oder T-Zell-Löschung. Wenn auch der kritischen molekularen Mechanismus der CP geklärt werden noch, gibt es sammeln Hinweise darauf, dass exogene Antigene durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau (ERAD) nach dem Export aus nichtklassischen endocytic verarbeitet werden Fächer. Bis vor kurzem waren Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen beschränkt, denn es keine spezifische molekulare Marker als exogene Antigene gab. Die hier beschriebene Methode ist ein neues Protokoll Vesikel Isolierung, die für die Reinigung dieser endocytic Abteilungen ermöglicht. Mit diesem gereinigten Microsome, rekonstituiert wir ERAD-wie Transport, Ubiquitination und Verarbeitung des exogene Antigen in Vitro, was darauf hindeutet, dass das Ubiquitin-Proteasom-System die exogene Antigen nach dem Export aus dieser verarbeitet Handy-Fach. Dieses Protokoll kann weiter auf andere Zelltypen zu klären, den molekularen Mechanismus der CP angewendet werden.

Um den molekularen Mechanismus der CP zu erhellen, ist es notwendig, die zellulare Fächer zu identifizieren, wo exogene Antigene ERAD-wie Transport und Verarbeitung unterzogen werden. Während Beobachtungen durch immunofluorescent Mikroskopie oder durch Elektronenmikroskopie der zelluläre Fach wo exogene Antigene16,17,18,19angesammelt...

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, den membranösen Kompartiment zu reinigen, in dem die ERAD-ähnliche Degradation exogener Antigene während der Kreuzpräsentation stattfindet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunabwehr zu beantworten, beispielsweise die Klärung des zellulären Kompartiments oder der ERAD-ähnlichen Degradation bei der Kreuzpräsentation. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die gereinigten Vesikel sämtliche molekularen Komponenten enthalten, die eine ERAD-ähnliche Degradation aller exogenen Antigene ermöglichen. Somit kann diese Methode Einblicke in die Kreuzpräsentation durch dendritische Zellen gewähren und ist ebenfalls auf andere Typen antigenpräsentierender Zellen anwendbar, die über Kreuzpräsentationsfähigkeit verfügen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es unmöglich ist, jeglichen unspezifischen Hintergrund vollständig auszuschließen. Einen Tag vor der Reinigung sollten die DC2.4-Zellen in einer Gewebekulturplatte in RPMI-Puffer auf 0,1 Millionen Zellen pro mL aufgeteilt werden. Vermeiden Sie es, die Zellen konfluent wachsen zu lassen, um die Wahrscheinl

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Reinigung von Photorezeptor-Fragmenten des äußeren Segments (POS) durch Ultrazentrifugation aus Schweine-/Rindernetzhaut unter Verwendung von Homogenisierung und Saccharosegradientenzentrifugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Vorbereitung großer Bestände an POS-Aliquoten, etikettiert oder unbeschriftet, die dann bei -80 °C gelagert werden können.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Hierin beschreiben wir zwei Ansätze zur Charakterisierung von Zellpolarisationsereignissen in B-Lymphozyten während der Bildung eines IS. Die erste betrifft die Quantifizierung der Organellenrekrutierung und Zytoskelett-Umlagerungen an der synaptischen Membran. Der zweite ist ein biochemischer Ansatz, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Zentrosoms zu charakterisieren, die polarisiert werden, um die Immunsynapse zu polarisieren.

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten in definierten Proteoliposomen vor.

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte SERCA-Aufreinigungsmethode, bei der das Disaccharid Trehalose in den letzten Zentrifugationsschritt einbezogen wird. Dieses Kohlenhydrat stabilisiert Proteine unter rauen Bedingungen. Das gereinigte SERCA war katalytisch aktiv und wies eine hohe Reinheit auf, wodurch es sich für strukturelle und funktionelle Studien eignete.

Aufreinigung des Sarko-endoplasmatischen Retikulums Ca2+-ATPase aus dem Kaninchenmuskel

Eine spezifische und sensitive Methode, um Einblick in die Expression von Glykosphingolipid Antigene Immunsystem Organe und Zellen zu gewinnen beschrieben. Das Verfahren nutzt die Ionenfallenmassenspektrometer ermöglicht stufenweise Fragmentierung Glycosphingolipid Moleküle zur Strukturanalyse gegenüber chemisch synthetisierten Standard.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Die Zellmembran Modifikation von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mit hyperverzweigten Polyglycerin (HPG) präsentiert wird. Geändert RBCs wurden durch wässrige Zwei-Phasen-Partitionierung, osmotische Fragilität und Komplement-vermittelte Lyse gekennzeichnet. Die Tarnung der Oberflächenproteine ​​und Antigene wurde anhand der Durchflusszytometrie und Micro Typing System (MTS) Blut Phänotypisierung Karten.

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von bakterieller RNA aus Listeria monocytogenes Bakterien, die in murinen Makrophagen wachsen. Diese Technik kann auch bei anderen intrazellulären Krankheitserregern und Wirtszellen von Säugetieren eingesetzt werden.

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Lernen Sie ein neues Vesikel-Isolationsprotokoll zur Aufreinigung membranöser Kompartimente für ERAD-vermittelten Abbau exogener Antigene in der Kreuzpräsentation. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in immunologische Prozesse.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

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