Сократительную способность измерения человеческого гладких мышц матки для разработки лекарственных средств помощи

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить влияние различных агонистов, антагонистов или новых агентов на сокращения миометрия человека ex vivo для изучения физиологии миометрия и проверки фармакологических данных, полученных с помощью новых исследовательских зондов или лекарственных препаратов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии и патофизиологии миометрия, включая преждевременные роды и дисфункциональные роды. Основное преимущество этой техники заключается в том, что после освоения она является относительно простой техникой, которая может предоставить полезную информацию о функциональных реакциях новых соединений in vivo.

Перед началом процедуры расположите одну перистальтическую питательную трубку на тканевую ванну вокруг роликов перистальтической головки насоса. Закрепите трубки фиксирующими упорами, затянув компрессионные кулачки и заблокировав ключи вокруг трубок. Поместите свободные концы перистальтических питательных трубок в литровую емкость физиологического раствора или ПСС и запустите насос, чтобы ПСС мог непрерывно проникать в тканевые ванны.

Поместите образец биопсии миометрия беременной женщины в прозрачную силастическую чашку для вскрытия, наполненную PSS, и поместите чашку под микроскоп. Тщательно ориентируйте биопсию, чтобы можно было визуализировать края серозы и децидуа. Закрепите салфетку на месте для посуды с помощью булавок для препарирования.

Используя объектив 10X, определите участки миометрия, свободные от рубцовой ткани, серозы, децидуа и прилегающих плодных оболочек. Затем с помощью больших ножниц рассекайте образец до тех пор, пока два соседних слоя ткани не будут разделены, обнажив две плоскости мышц. Закрепите каждый уголок кусочков ткани дополнительными булавками и осмотрите листы мышц на наличие волокон, идущих параллельно.

Захватывая ткань вдоль первоначального края разреза, с помощью небольших ножниц для рассечения собирайте полоски ткани вдоль продольной оси и выравнивая направление мышечных волокон до тех пор, пока не будет получено соответствующее количество полосок. Приколите каждую полоску с обоих концов, чтобы расправить и закрепить образцы на блюде, стараясь не перетянуть ткани. Затем прикрепите алюминиевые зажимы для салфеток к каждому концу полоски так, чтобы длина салфеток между зажимами составляла примерно пять миллиметров, и аккуратно отрежьте лишнюю ткань.

Чтобы установить ткани, перенесите полоски в экспериментальные тканевые ванны и прикрепите один конец каждой полоски с помощью зажима к преобразователю силы, а другой конец к неподвижному крючку внутри тканевой камеры. Убедитесь, что полоски находятся у основания каждого крючка в ванне, и откройте программное обеспечение для записи. Щелкните правой кнопкой мыши по оси y.

Выберите «Задать масштаб» и введите 10 для максимального значения масштаба и ноль для минимального значения, а затем нажмите «ОК». Повторите для каждого канала записи. Нажмите кнопку «Запись», чтобы начать запись в реальном времени, и поверните микроманипуляторы, прикрепленные к каждому датчику, чтобы вручную растянуть каждую ткань, следуя восходящему движению ткани от исходной линии, пока напряжение не достигнет 0,2 грамма.

Подтвердите, что полоски находятся у основания каждого крючка. Затем дайте тканям сбалансироваться в течение примерно двух часов, пока не возникнут спонтанные сокращения. Чтобы проверить влияние конкретных соединений, представляющих интерес, на сократимость мышечной полоски, поместите трубку подачи для первой тканевой ванны в стеклянную лабораторную бутылку, содержащую самую низкую концентрацию экспериментального реагента, разведенного в PSS, и запишите время нанесения.

Важно точно отмечать время применения каждого экспериментального реагента как в самой программе записи во время эксперимента, так и в лабораторном блокноте, чтобы помочь в последующем анализе данных. Повторяйте процесс для каждой возрастающей концентрации, последовательно помещая трубку подающего устройства в стеклянную лабораторную бутылку, содержащую следующую концентрацию в серии, пока не будут применены все концентрации. После того, как будет проверена последняя концентрация, верните трубки подачи в бутылку с PSS, чтобы промыть систему, и нажмите «Стоп», чтобы завершить запись в реальном времени.

Сохраните данные в соответствующую папку и экспортируйте версию в виде файла dot mat. Затем импортируйте файл dot mat в соответствующее программное обеспечение для анализа и постройте данные в виде графика координат x-y. После периода стабильной активности под действием окситоцина в этом репрезентативном эксперименте антагонист рецепторов окситоцина атозибан применяли в возрастающих логарифмических концентрациях, и рассчитывали амплитуду и площадь под кривой для каждой применяемой концентрации, выявляя ожидаемую косвенную корреляцию между концентрацией этого известного антагониста и сокращаемостью мышцы.

Воздействие на полоски миометрия человека нового соединения в тех же экспериментальных условиях не привело к общим изменениям в сократительной способности мышц. Предварительное равновесие аргинин-вазопрессина, однако, продемонстрировало зависящее от концентрации уменьшение сокращений миометрия человека с каждым увеличением концентрации нового соединения, аналогично реакции, наблюдаемой при увеличении концентраций известного антагониста, SR 49059, что свидетельствует о селективности нового соединения по отношению к рецептору вазопрессина по отношению к рецептору окситоцина. После того, как эта техника будет освоена и выполнена должным образом, она может быть завершена, и данные могут быть сгенерированы за шесть-восемь часов.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить о необходимости поддерживать гидратацию образцов тканей и поддерживать температуру тканевых ванн в диапазоне от 36 до 37 градусов по Цельсию. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как вестерн-блоттинг, иммуногистохимия или количественная полимеразная цепная реакция, чтобы ответить на дополнительные вопросы об изменениях в экспрессии белка или генов в тканевых полосках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно препарировать и использовать полоски человеческого миометрия для определения функциональных и биологических реакций данного соединения на сокращение миометрия.

Не забывайте, что работа с тканями человека может быть опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать стандартные меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты. Кроме того, перед началом работы необходимо получить соответствующее одобрение этического и институционального наблюдательного совета.