熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製

この技術の主な利点は、再現性の高い勾配パターンを生成でき、寄生虫の観察構造に対する細胞応答のスクリーニングが可能になることです。物理的刺激に対する反応は、まだ完全には発見されていません。私たちの手法は、これらの未知のメカニズムを解き明かすための重要なツールになると考えています。

まず、電解研磨液が入ったダブルジャケットビーカーをサーキュレーターに接続し、温度を摂氏7度に設定します。温度が摂氏7度に下がるまで、溶液を少なくとも30分間攪拌したままにします。超高純度のアルミニウム板とカーボン対極を、ワニ口クリップと銅線を用いて電解研磨液に浸漬します。

カーボン対極のアルミ板の位置を合わせるように調整します。アルミニウムプレートを正極端子に接続し、カーボン対極を直流電源の負極に接続します。20ボルトの電圧を印加すると、アルミニウム板の表面はざらざらした光沢のない表面から、鏡のような銀

一次陽極酸化を行うには、1リットルの電解液を2リットルのダブルジャケットビーカーに注ぎます。研磨されたアルミニウム板とカーボン対極を銅線のワニ口クリップで溶液に浸しました。U字型の台座に垂直シャフトを取り付けます。

オーバーヘッドスターラーとインペラを金属クランプで取り付けます。インペラのプロペラを両方の電極の下端近くに配置します。オーバーヘッド攪拌の回転速度を200〜300rpmに設定し、16時間攪拌しながら195ボルトの電圧を印加します。

一次陽極酸化後、アルミニウム板の色は銀色から灰色に変わります。アルミナのかゆみを行うには、陽極酸化アルミニウム板をエッチング液に浸します。ビーカーの上部をアルミホイルで密封し、少なくとも10時間攪拌します。

エッチング工程では、アルミ板の色がグレーからホワイトに変わります。二次陽極酸化については、一次陽極酸化と同じ実験条件を設定し、再度195ボルトの電圧を6時間印加します。二次陽極酸化後、アルミニウム板の色は白から灰色に戻ります。

グラジエント細孔拡大を行うには、まずリン酸溶液が入ったダブルジャケットビーカーをサーキュレーターに接続し、温度を30°Cに設定します。ビーカーの隣に垂直に直線移動ステージを配置し、直線ステージの移動部分にブラケットを取り付けます。リニアステージの移動部分をホームポジションにセットします。

ブラケットのクリップを取り付け、陽極酸化アルミニウムプレートをロードします。アルミニウム板の位置を手動で操作して、アルミニウム板が溶液の表面のすぐ上に来るようにします。アルミニウム板を毎秒4ポイント86ミクロンの速度で溶液に120分間徐々に浸し、120ナノメートルから200ナノメートルのサイズ勾配を持つ35ミリメートルのAAOモールドを作成します。

アルミニウム板が溶液の表面に触れた瞬間にストップウォッチを始動します。100分が経過した後、AAO型の半分が溶液に含まれるはずです。GP200〜280、GP280〜360の金型を作るには、GP120〜200の金型の全領域をそれぞれ2〜4時間、細孔拡大液に浸漬しました。

AAOモールドとピラニア溶液を非金属ピンセットを使用して30秒間浸します。AAOモールドを脱イオン水で数回すすいでください。型を脱イオン水に30分間浸し、さらにメチルアルコールに30分間入れます。

AAO型を真空下で3時間完全に乾燥させました。自己組織化単分子膜の堆積には、AAO型を57ミリリットルのろ過済みヘキサンと100ミリリットルのビーカーに浸します。次に、Nヘキサンに3ミリリットルのHDFS原液を加えて2.9ミリモルのHDFS溶液を作り、反応が進行するまで10分待ちます。

AAO型を新鮮なヘキサンに移した後、AAO型を60ミリリットルのメトキシノナフルオロブタンに浸しました。ビーカーでAAOモールドを1回あたり10秒間超音波洗浄し、物理的に吸着したHDFS分子を除去します。洗浄手順を10回繰り返してから、AAO型を真空下で24時間乾燥させます。

厚さ1mmのポリスチレンシートを1点、幅9mm、長さ3点7mmのサイズにプリント基板カッターでカットします。クリーンルームでの作業で、AAO型を下から35mmのところにニッパーでカットします。裏面にサンプル名とデータメーカーをマークします。

8ポイントゼロインチのウェーハを少量のエチルアルコールで洗浄し、ポリスチレンシートをウェーハに置き、AAOモールドを取り付けます。次に、下部のフィルムをサーマルインプリンターの引き出しに入れて上部のフィルムをガスケットに貼り付け、次にウェーハを下部のフィルムに置き、ガスケットをウェーハに置きます。ウェーハにほこりが付着していないことを確認してください。

サーマルプリンターの引き出しを閉じた後、100秒から165°Cの熱と620ポイント5/2キロパスカルの圧力を加えます。次に、サンプルを室温に冷却します。冷めたら、チャンバーを通気すると、圧力が0キロパスカルまで下がります。

ポリスチレンシートを軽くひねってAAOモールドを離します。ヘパリン阻害剤チューブを使用して50ミリリットルのヒト血液を採取します。15ミリリットルのチューブに6ミリリットルの親水性多糖溶液を入れ、8ミリリットルの血液を親水性多糖溶液に加えます。

血液はすぐに採取し、親水性多糖溶液の上にゆっくりと加える必要があります。チューブをGの1020倍で20分間遠心分離して細胞をペレットした後、不透明な細胞層を回収し、新しい15ミリリットルのチューブに移します。10%FBSを含むPBSの10ミリリットルで、Gの1020倍で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

上清を取り除き、赤血球溶解バッファーを追加します。10%FBSを含むPBSで氷上で5分間インキュベートした後、チューブをGの1020倍で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を取り除き、10%FBSを添加した内皮細胞増殖培地1ミリリットルを追加します。

各コラーゲンコード皿のウェルあたり8ポイントゼロ百万個の細胞を播種します。テキストプロトコルに記載されているように、ヒトおよびエーテルコロニー形成細胞を誘導し、さらなる実験のために細胞を継代7まで成長させます。次に、グラジエントナノパターンプレートをPBS中のゼロポイント1パーセントタンパク質コーティング溶液1ミリリットルで室温で10分間コーティングします。

トリプシンを用いた標準的な細胞分裂法により、培養皿からヒトECFCの懸濁液を作製します。細胞懸濁液を希釈して所望のコンフルエンスを達成した後、ヒトECFCをフラットコントロールでグラジエントナノパターンプレートに播種停止します。フラットまたはグラジエントナノパターンプレート上の細胞をインキュベーターで2日間培養します。

これらの画像は、3つの異なる流し幅拡大条件下で製造されたAAO金型を示しています。リン酸エッチング液に浸漬する時間が最短の一方の面は細孔径が最も小さく、エッチング液に浸漬する時間が長いもう一方の面は細孔径が最も大きくなります。ナノパターンを熱インプリント法によりポリスチレンに転写したため、ポリスチレン表面にナノピラー構造が生成され、ナノパターンプレートではAAOモールドのサイズ勾配が維持されます。

コンフルエントなヒトECFCは、典型的な丸石のような形態を示し、位相差顕微鏡で容易に区別できるコロニーを知らせます。グラジエントナノパターンプレートのフラット上でヒトECFCを2日間培養した後、GP 120〜200で培養した細胞で有意な糸状仮足の増殖が観察されました。逆に、フラットコントロールと比較して、GP 200から280またはGP 280から360では顕著な変化は観察されませんでした。

この結果は、表面のナノ構造のサイズによって細胞の応答が異なることを示しています。ナノパターンプレートを作製するには、多くのステップがあります。そのため、最初は複雑になる可能性がありますが、一度習得すると、問題なく欲望のサイズのグラデーションでパターンを降りることができます。

このビデオを見た後、あなたはグラデーションナノパターンプレートを製造する方法と、ナノパターンプレート上でヒトと愚かなコロニー形成シリーズに培養する方法をよく理解しているはずです。また、この方法はさまざまなタイプのシリーズで使用できます。この方法は、材料工学とバイオテクノロジーの間の架け橋となり、細胞の注入と表面ナノトポグラフィーを理解するのに役立ちます。