Name: הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: למד את שיטת ההכרחה לניתוח מיומנות וקטור של יתושי Aedes albopictus ו-Culex לנשיאת וירוס זיקה. שיטה זו מאפשרת בדיקה בו-זמנית של עד 50 יתושים בשעה אחת ללא שימוש בבעלי חיים במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אלה Weinert, מישל הלמס, Marlis Badusche לסיוע טכני מעולה, ג'סיקה Börstler עבור ניתוחים של יתושים כולכית , נורברט בקר, ביורן Pluskota לאספקת ביצים אדס , אולי Vapalahti עבור מתן המניה וירוס. ML נתמכה על ידי האגודה לייבניץ; הענק מספר המסור-2014-SGN-3.

1. מכינים יתושים הנשי
<ol><li>לאסוף יתושים כלוב גדול על-ידי שימוש של העצמות (כ- 400 יתושים לכל כלוב גדול).</li>
	<li>עזים ומתנגד היתושים עם פחמן דו-חמצני (CO2) עבור 7 s.</li>
	<li>למיין נקבות 20 לכל בקבוקון פלסטיק (Ø 50 מ"מ × 100 מ"מ). הערה: אם היתושים מתעורר, השתמש עוד 3 s של CO2-
</li>
	<li>להרעיב את היתושים בן לילה.</li>
</ol>2. ארוחת דם מלאכותי
הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>
להכין את הארוחה דם זיהומיות.
	<ol>
<li>לדלל את המניה וירוס לריכוז פלאק עונה 1 פרק 108 יחידות (PFU) ויוצרים / mL. הערה: ריכוז מניות היה נקבע על-ידי ביצוע פעולת שירות במינון 50 זיהום תרביות רקמה (TCID50), המחושב על-ידי ספירמן & Kärber אלגוריתם10,11.</li>
		<li>מיקס שפג תוקפו (שימור דם) דם אנושי מבנק הדם (אינו מתאים אנושיים יותר, אבל שימושי עבור יתושים) עם פרוקטוז (8% פתרון), בפילטר סרום שור (FBS) ואת הפתרון עובד של המניה וירוס (פג האנושי דם: פרוקטוז: FBS: הפתרון עובד = 5:3:1:1). הערה: בחרנו דם אדם, כי זה המארח יונק טבעי הידוע של ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להקפיא µL 140 של שילוב ארוחת דם לצורך ניתוח נוסף באמצעות TCID50.</li>
	<li>
לבצע הזנה מלאכותית באמצעות שיטות האכלה שונים, בהתאם למין:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: להשתמש קרום האכלה המערכת במשך 30 דקות (1 מ"ל לכל מזין).</li>
		<li>
כולכית spp.: לספק את הדם זיהומיות באמצעות מקל צמר גפן בין לילה, לא לחמם את הדם (300 µL לכל מבחנה).</li>
		<li>
אדס מפוספס: שתי טיפות (50 µL כל) של המיקס ארוחת דם לתוך הבקבוקון פלסטיק וניתן היתושים להאכיל במשך שעתיים. לא לחמם את הדם. הערה: יתושים אאכיל הראשון באינטרקום. זמן הדגירה ממושך נחוץ מסיבות בטיחות. טיפות דם מנוקזות לאחר 2 h, שובכך את הסיכון לזיהום מצטמצם במהלך המיון של האכלת יתושים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עזים ומתנגד היתושים עם CO2 עבור 7 s. הערה: אם היתושים מתעורר, השתמש עוד 3 s של CO2.</li>
	<li>מיון וספירה צבה מלא יתושים לתוך בקבוקון חדש.</li>
	<li>להוסיף כרית כותנה, רווי פרוקטוז (8% פתרון) בין המבחנה פקק.</li>
	<li>לשמור היתושים בטמפרטורה המיועד של 18 ° C או 27 ° C בלחות של 80% 14-21 ימים.</li>
	<li>להאכיל את הזבובים עם ריפוד כותנה רווי פרוקטוז. לחדש כל 72 h עם 1.5 מ של פרוקטוז (8% פתרון) לכל מבחנה (עד 20 היתושים, בהתאם ההזנה לדרג, ראה שלב 2.5).</li>
</ol>3. הכריחו ריור Assay ביום 14 או 21
הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>2 x 104 Vero תאי זרע / לכל טוב ב- 96 ובכן צלחת עם 200 µL של מדיום הגידול (Dulbecco´s שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 3% FBS, פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 5 µg/mL המפוטריצין, 2 מ מגלוטמין חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), 1% נתרן פירובט).</li>
	<li>
הכן את התקן ריור:
	<ol>
<li>מניחים צלחת זכוכית בריבוע (20 × 20 ס מ) על הספסל ב זווית של 30 מעלות. הערה: זה נחוץ בשל תראי במעבדה בטיחות. אם הצלחת אופקי או אנכי, נוזל ידלוף.</li>
		<li>במקום פעמיים דבק צדדית על גבי לוח הזכוכית.</li>
		<li>תפקיד החימר דוגמנות עד שהוא מגיע בקוטר של 0.5 ס מ ולחבר אותו אופקית 1 ס מ מן הקלטת דבק דו צדדי.</li>
		<li>חתוך את 0.3 ס מ הראשון של הקצה של קצה מסנן 10 µL. הערה: מומלץ להכין את זה לפני תחילת הניסוי מחוץ למעבדה אבטחה.</li>
		<li>למלא את הטיפים מסנן 10 µL של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7.4).</li>
		<li>מניחים את הטיפים מסנן על החימר דוגמנות עם הקצה לקראת הקלטת דביק.</li>
		<li>אבטח את הטיפים מסנן עם לחץ עדין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכן את היתושים:
	<ol>
<li>עזים ומתנגד היתושים עם CO2.</li>
		<li>הסר את הרגליים ואת כנפיים כדי לשתק את היתושים.</li>
		<li>לתקן את היתוש חי גופות בקלטת דביק מעל טיפ מסנן.</li>
		<li>הנח את חוטם בעדינות לתוך קצה מסנן.</li>
		<li>הפעל וזמינותו ריור למשך 30 דקות.</li>
		<li>הסר את הטיפים מסנן ולמחוק את קליי ואת הסרט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. עיבוד של רוק
הערה: השלבים 4.1 – 4.6.2 מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>לגרש את התוכן לתוך הצינורות התגובה המכיל 10 µL ל- PBS.</li>
	<li>לערבב בעדינות, להעביר את התוכן לתוך הבארות של הלוח מוכן היטב 96 באמצעות באר אחת עבור דגימה.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת של 7 ימים ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>השתמש התאום כדי לבדוק את התאים לנוכחות של אפקט ציטופתי (CPE).</li>
	<li>אם גם הוא חיובי עבור CPE, לקצור את תגובת שיקוע על-ידי pipetting 140 µL לתוך צינור התגובה לחילוץ RNA.</li>
	<li>
לטהר את הרנ א באמצעות ערכת חילוץ RNA.
	<ol>
<li>µL 140 מיקס של תגובת שיקוע עם µL 560 של AVL מאגר (פירוק ויראלי מאגר), תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף µL 560 של אתנול (96%) ו מערבולת המדגם. הערה: הדוגמאות הן לא פעיל לאחר שלב זה, יכול להיות משוחרר מחוץ למעבדה BSL-3.</li>
		<li>Pipet 630 µL של המדגם על עמודה בעלת צנטריפוגה עם 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>למחוק את פילטרט של, pipet µL 630 הנותרים על העמודה וחזור על צנטריפוגה.</li>
		<li>לשטוף את הרנ א, חייב הקרום של העמודה, על-ידי הוספת µL 500 לרחוץ את מאגר 1 עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור אוסף חדש. להוסיף 500 µL כביסה מאגר 2 ו צנטריפוגה ב x 12,500 g למשך 3 דקות.</li>
		<li>למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור התגובה 1.5 mL.</li>
		<li>הוסף µL 50 • תנאי מאגר ' תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 6,000 g עבור 1 דקות ולאחר מכן למחוק את העמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את הדגימות עבור ZIKV RNA באמצעות RT-qPCR.</li>
</ol>5. עיבוד של גופים יתוש
הערה: השלבים 5.1 – 5.5 מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>הסר את הגופות של היתוש ומניחים כל גוף לתוך צינור התגובה. הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של התקשורת המגון (DMEM ללא כל supplementals) לתוך הצינור התגובה.</li>
	<li>Homogenize על הגוף באמצעות מנוע במיקסר ולהשתמש פיסטיל חדש עבור כל דגימה.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של homogenate 96-ובכן-צלחת לטיהור. הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בטל את הצלחת על ידי הדגירה למשך 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לטהר את הרנ א על ידי טיהור חומצת גרעין אוטומטית. הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>6. ניתוח
<ol><li>לכמת את העותקים RNA נגיפי באמצעות RT-qPCR. הערה: העותקים RNA היו בממוצע על כל הגופים יתוש ZIKV-חיוביים וללא כולל את היתושים ZIKV-שלילי.</li>
	<li>חישוב IR, כהגדרתו מספר הגופות יתוש ZIKV-חיובית לכל מספר נקבות נמאס.</li>
	<li>לחשב את TR, הגדיר את המספר של יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר חיובי ZIKV יתושים הגופות. לא ניתן לחשב קצב השידור עבור שילובי מינים-הטמפרטורה ללא גוף ZIKV-חיוביות.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region">http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region</a> (2016).</li>
<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
<li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li>
<li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+selected+African+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29+species+for+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li>
<li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li>
<li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+salivation+and+virus+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li>
<li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li>
<li>Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Eurovsurveillance%22%5BJournal%5D)">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li>
<li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124653306500038">Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual</a>. , (1996).</li>
<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
<li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites & Vectors. 8, 463(2015).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeger-Lucarelli%2C+J+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22">PLOS Neglected Tropical Diseases</a>. Turell, M. J. 10 (10), (2016).</li>
<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר הוכח כי התוצאות המתקבלות עם ריור בכפייה עולים בקנה אחד עם קלאסית ניסויים מחדש האכלה6. עם זאת, מחדש האכלה ניסויים והן בשיטה שלנו הציג ריור בכפייה, זה בלתי אפשרי ישירות הוכחה פעילות ריור או לפקח על שחרורו של הרוק. כדי להוכיח פעילות ריור, דגימות נבדק עבור רכיבים אחרים להציג הרוק (למשל., חלבונים, פחמימות, וכו '.). יתר על כן, qPCRs נוספים תאפשר איתור נגיפי RNA עותקים. זאת, לעומת זאת, דורשת פיצול של דגימות רוק עבור ניתוחים שונים, אשר עשוי להגביל רגישות בשן וזמינותו תרבות תא במקרה של מספרי החלקיקים נמוך מאוד. בתורו, זה עלול להוביל underestimation של קצב שידור נחוש.
לתוצאות לשחזור, זה הכרחי להבטיח כי כל היתושים להישאר בחיים עד סוף הניסוי. זה נשלטת על ידי חזותית ניטור פעילות תנועת הגוף של היתושים. בנוסף, השימוש בעיקרון וזמינותו ריור עבור זן יתושים נתון יש להיבדק על ידי האכלה לשלוט וירוסים, אשר ידועים להיות מועבר על ידי מינים יתושים הספציפי הזה. ולהיפך, כל וירוס מוחדרים ניסוי צריך להיבחן. יתוש רגישים.
מבחני ריור בכפייה יש יתרונות רבים. מספר גבוה של יתושים יכול להיבדק בו זמנית על להצטננות הבסיס בתנאים מתוקננים מבוקרים מבלי לגרום להתנגשויות עם תקנות רווחת בעלי חיים9.
השיטה משמשת מספר מעבדות. עם זאת, כיוונוני המדויק עשויים להיות שונים, אשר יכול להוביל הבדלים בתוצאות בין מעבדות. מרכיב קריטי אחד הוא נימי כדי לאסוף את הרוק, אשר יכול להיות עשוי זכוכית14 או פלסטיק15. עמידה בהוראות הבטיחות גבוהה של insectary רמה 3 אבטחה, השתמשנו טיפים מסנן מפלסטיק במקום נימי זכוכית, ובכך להקטין את הסיכון לפציעות. יתר על כן, מסנן טיפים יש יתרון כי הנוזל נאסף ניתן בקלות להעביר באמצעות פיפטה.
ההתקנה של וזמינותו ריור בכפייה המובאת כאן מבוסס על שני החוקרים עובדים ביחד ושיתוף חובות. Demobilizing של היתוש מבוצעת על ידי אדם אחד, בעוד השני בו זמנית מכין את הכיוונון ריור בכפייה. זו מפחיתה את זמן הטיפול, ממזער את הסיכון באופן משמעותי מדגם מיתוג כמו שינוי בין שהשתחררתי-העבודה ריור-הצלחת אינה נחוצה. יתר על כן, היא מאפשרת הצבת היתושים על המכשיר ריור בכפייה מיד אחרי שהשתחררתי. יתוש הקצרים זה טיפול זמן חיוני מוצלחת ריור בכפייה. לבסוף, היתושים ניתן לנטר באופן ישיר על תנועתיות לאורך כל הניסוי כולו.
וזמינותו ריור המובאת כאן משמש כדי לקבל תובנות לגבי הפוטנציאל וקטור של מינים יתושים. עם זאת, כדי לענות על שאלות ספציפיות אחרות (למשל., המספרים של עקיצות יתושים הדרושות כדי להדביק בעלי חוליות), חיה ניסויים עדיין ייתכן שיהיה צורך.

בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV), הקשורים בעקיצות יתוש וירוס (mobovirus) השייך למשפחת Flaviviridae, יצא ב קולומביה וברזיל והתפשטה במהירות ברחבי אמריקה והאיים הקריביים, לגרום מגיפה עם מספרים הבולטים מקרים קליניים של microcephaly, תסמונת גיליאן-ברה1. היתושים של המין Aedes aegypti ו אדס נחשבים הווקטורים הראשיים והמשניים של ZIKV2, אבל גם הוכיחו מינים אחרים של הסוג אאדס יש וקטור ניסיוני מיומנות3 . בניגוד מינים אאדס , לרוב המינים כולכית נבדקו עד כה אינם מסוגלים להעביר את הוירוס4. בסך הכל, הנתונים עבור כולכית quinquefasciatus סיפק תוצאות חד משמעיות3. בזמן הנוכחי, מידע חסר על כשירות וקטור יתוש ZIKV בתנאים הטמפרטורה מתונה (< 20 ° C). עם זאת, מידע זה הוא משמעותי עבור הערכות סיכונים אפשריים כפולות באזורים בעלי אקלים ממוזג כגון מרכז אירופה.
וקטור המוסמכים עבור ZIKV הוא מסוגל לרכוש, לתחזק, להגביר, לבסוף לשדר את הוירוס. לכן, בדיקה של יתוש גופות או חלקי הגופות, כולל הרגליים, פיתול, ראש או בלוטות הרוק, ZIKV אינה מספיקה לקבוע וקטור מיומנות. זה הכרחי לבדיקת חלקיקי וירוס זיהומיות בתוך הרוק שפורסמו כדי להעריך את היכולות וקטור, שיעור הזיהום (אינפרא-אדום, מספר הגופות יתוש ZIKV-חיובית לכל מספר של יתושים הנפוחים) וגם קצב השידור (TR, מספר יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר הגופות יתוש ZIKV-חיוביים), חייב להיות נחושה. מס הכנסה של יתושים ניתן לנתח בקלות על ידי יתושים פשוט homogenizing ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת-טרנסקריפטאז (RT-qPCR) מיקוד ZIKV. יתר על כן, הזיהום ניתן לאפיין עוד יותר על-ידי קביעת המספרים ויראלי עותק לכל יתושים. לעומת זאת, הניתוח של קצב שידור מסתמך על הגילוי של חלקיקי וירוס קיימא על ידי יתושים בודדים. זו יכולה להיות מושגת על ידי האכלה של יתושים נגועים על חיות מארח רגישים, ואחריו הניתוח של viremia מארח5. עם זאת, שיטה זו מתבססת על מודל מתאים אורגניזמים, מוגבלים על ידי תקנות רווחת בעלי החיים ולא יקר. כדי למנוע השימוש של חיות מעבדה לניתוח קצב שידור כדי להפחית עלויות, מלאכותי מחדש האכלה מערכות דם טיפות היו תיאר6. אולם, בדיקה בסולם בודדים בשילוב עם מספר גבוה של אנשים היא וממושכת. התיאור הראשון של וזמינותו ריור בסולם בודדים פורסם בשנת 19667 , במהלך השנים האחרונות, ריור בכפייה ניסויים הפכו שיטת הבחירה כדי להעריך בדונו וקטור של יתושים3,8 .
בהתבסס על המחקר את היכולות שלנו וקטור של מרכז אירופיות יתושים שפורסם לאחרונה9, נתאר ריור בכפייה כפי שדווח על ידי אנדרסון ואח. 8 עם מספר שינויים. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה סטנדרטית ניסויים בתנאים רמת אבטחה גבוהה (BSL-3), כולל זיהוי וירוס פעיל על ידי מבחני תרבות המבוססת התא. הניסויים המתוארים כאן כוללים יתושים 856. הם היו נגועים ZIKV על ידי ארוחת דם מלאכותי, לאחר מכן נותחו לנוכחות של חלקיקי וירוס מדבק ברוק. היתושים מוחדרים ניסויים כללה שתי האוכלוסיות מעבדה ותיקה של Ae. aegypti , כולכית מצויה מצויה biotype molestus (Cx. פ molestus), כמו גם שדה נתפס כולכית מצויה מצויה biotype מצויה (עמ' מצויה Cx.), כולכית torrentium (Cx-torrentium), שתי האוכלוסיות Ae. albopictus . למעט אחד של Ae. albopictus שתי האוכלוסיות, אשר נאסף באיטליה, כל היתושים היו שנאספו בגרמניה.

<table><tbody><tr><td>הזרקה + הזרקת שינה</td><td>מתמטית + כלוב</td> גידול חרקים <td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1</td><td>חנות Dorm צינורות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גידול דרוזופילה</td><td>קארל רוט</td><td>PK11.2</td><td>בקבוקון פלסטיק ליתושים</td></tr><tr><td>תקע לצינורות גידול דרוזופילה</td><td>קארל רוט</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>קלסר תא אקלים קבוע</td><td></td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>דם אנושי בנק, פג תוקפו, לא שמיש ליישום רפואי</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette אלקטרוני SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>תאי Vero</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שואב אור פלאש</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>סרט</td><td></td><td></td> דבק דו צדדי <td>ללא ספק ספציפי</td></tr><tr><td>כפפות ללא אבקה של Gammex עם AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>מטעמי בטיחות הדרושים במהלך העבודה עם דקירות במעבדת BSL3</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona אבחון</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA / DNA ערכת</td><td>Thermo fisher 4462359 מדעי</td><td></td><td>RNA של גופי יתושים</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-בידוד של</td></tr><tr><td>מסנן סופרנטנט טיפים (20 ומיקרו; L)</td> <td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>חתוך את 3 מ"מ הראשונים של מערבל</td></tr><tr><td>המנוע היד</td><td>קארל רוט</td><td>נמכר מיקרו</td><td></td></tr><tr><td>עליים למיקסר מנוע יד</td><td>קארל רוט</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L גלוטמין פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>פרוקטוז</td><td>קארל רוט</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr> P0832100 <tr><td>Hemotek מזין</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>חימר</td><td></td><td></td> דוגמנות <td>ללא ספק ספציפי</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aedes albopictus</td><td></td><td></td><td>ביצים נאספו בפרייבורג, גרמניה</td></tr><tr><td>משקפת</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>אור דו-עיני</td><td></td><td>MOTIC MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>תרמו מדעי</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

וקטור כשירות מוגדר את הפוטנציאל של זן יתושים לשדר בעקיצות יתוש וירוס (mobovirus) למחשב מארח חוליות. חלקיקי וירוס קיימא מועברים במהלך ארוחה דם דרך הרוק של יתוש נגוע מספיקה. ריור בכפייה מבחני לאפשר קביעת פוטנציאל וקטורי על בסיס יחיד היתושים, הימנעות השימוש של ניסויים בבעלי חיים. השיטה מתאימה לנתח מספר גדול של יתושים בניסוי אחד בתוך תקופה קצרה של זמן. ריור בכפייה מבחני שימשו כדי לנתח 856 יתושים בודדים לכוד בתוך גרמניה, כולל שני שונים כולכית מצויה מצויה biotypes, כולכית torrentium , כמו גם אדס, אשר נדבקו ניסיוניים בווירוס Zika (ZIKV), מודגרות 18 ° C או 27 ° C שניים או שלושה שבועות. התוצאות הצביעו על חוסר כשירות וקטור של taxa שונים כולכית עבור ZIKV. לעומת זאת, אדס היה רגישים ZIKV, אבל רק ב 27 ° C, עם קצב שידור דומה המושבה מעבדה Aedes aegypti נבדקו במקביל.

Aedes aegypti ידועה כמו וקטור המוסמכת ZIKV לפחות תחת תנאי אקלים טרופי12. לכן, אנחנו משתמשים Ae. aegypti כפקד חיובי להקים וזמינותו לנתח מס הכנסה, כמו גם TRs-בטמפרטורת דגירה של 27 ° C ולחות של 80%. IR ו TR הוגדרו תיאר כאמור מאת פורטונה ואח. 13. תיגר Ae. aegypti הראה IR של 50% ו 72% ו TR של 42% ו- 31%-14 ל-21 יום פוסט זיהום (dpi), בהתאמה (איור 1A ו 1B). לאחר מכן, יתושים האירופית נבדקו עבור זיהום ZIKV ושידור באמצעות תנאי אקלים טרופי, כמו גם ממוזג.
בטמפרטורת דגירה 27 ° C, מינים יתושים כל הראו זיהום ZIKV 14 dpi, כמו גם dpi 21, למעט יחידים Cx. עמ' מצויה ו- Cx-torrentium , אשר היו חיוביות ב- 14 dpi בלבד. כל המינים אאדס הראה מס הכנסה גבוה יותר (בין 50% ל- 72%) כמו גם ריכוז גבוה יותר של RNA נגיפי (106 עד 10 דגימות עותקים/יתוש9 RNA) בהשוואה taxa שונים כולכית , שחשף מס הכנסה הנעים בין 0 % ו-32% והמון ויראלי של 103 -104 RNA עותקים/יתוש דגימות. כל המינים אאדס מוצג ZIKV-חיוביות רוק (TR 13 – 42%), בעוד אף אחד דגימות רוק מן taxa כולכית הכילה ZIKV (איור 1A ו 1B). מעניין, קצב שידור ב- 21 dpi היו דומים ב Ae. aegypti ו Ae. albopictus מגרמניה (30%), אך היו נמוכות משמעותית ב- Ae. albopictus מאיטליה (13%).
דגירה של יתושים מאותגר בטמפרטורה מתונה של 18 ° C נחשף בדרך כלל וירוס התחתון טוען המין Aedes (104–106 RNA עותקים/יתושים) וכן את taxa כולכית שונים (102 –104 RNA עותקים/יתושים). עם זאת, בטמפרטורת דגירה 18 ° C, שידור של ZIKV נצפתה לא עבור כל המינים יתושים חקר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> איור 1: קצב שידור של יתושים נגועים השפעול ZIKV. תוצאות של מחקרים כשירות וקטור עם ZIKV במינים שונים נגד יתושים. 6 taxa יתושים שונים היו נגועים ZIKV, מודגרות עד 27 ° C או 18 ° C 14 (א) או 21 ימים (B). TR מוגדר כמספר של יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר חיובי ZIKV יתושים הגופות. המספר הכולל של יתושים חקר היה 856, עם מינימום של 30 אנשים בגין taxa נקודה/טמפרטורה/יתושים כל הזמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות המועברות על ידי יתושים, כגון האם מין יתוש הוא וקטור מתחרה לנגיף מסוים או לא. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שניתן לנתח כמות גדולה של יתושים בו זמנית, ללא שימוש בחיות מעבדה כמו עכברים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיא זקוקה למוטוריקה עדינה שניתן לרכוש רק באמצעות תרגול.הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי המפתח; הם דורשים ניסיון בטיפול ביתושים ווירוסים, וגם מיומנויות מוטוריות עדינות. כדי להתחיל, יש לדלל את מלאי הנגיף. לאחר מכן, ערבבו דם אנושי שפג תוקפו עם פרוקטוז, סרום בקר מסונן ומלאי הנגיף.הקפיאו 140 מיקרוליטר של תערובת קמח דם לניתוח נוסף באמצעות TCID50. לאחר מכן, הכניסו שתי טיפות של 50 מיקרוליטר מתערובת קמח הדם בבקבוקון פלסטיק, ואפשרו ליתושים להאכיל במשך שעתיים. לאחר הרדמת היתושים, ספרו את הפרטים התפוסים במלואם, והעבירו אותם לבקבוקון חדש המכיל כרית כותנה ספוגה בפרוקטוז.לאחר מכן, שמרו על היתושים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו-80% לחות למשך 14 או 21 יום. מלאו את רפידות הכותנה רוויות הפרוקטוז כל 72 שעות ב-1.5 מיליליטר פרוקטוז. ראשית, זרע 20,000 תאי Vero לבאר בצלחת של 96 בארות עם מצע גידול משלים.להכנת מכשיר הרוק, הניחו צלחת זכוכית מרובעת על הספסל בזווית של 30 מעלות. לאחר מכן, הדביקו סרט דו צדדי לחלק העליון של צלחת הזכוכית. לאחר מכן, גלגלו חימר דוגמנות עד לקוטר של 0.5 סנטימטרים, והצמידו אותו לצלחת אופקית במרחק של סנטימטר אחד מהסרט הדו-צדדי.חתכו את הקצוות מהמספר הנדרש של קצות מסנן של 10 מיקרוליטר, ומלאו כל קצה ב-10 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, הניחו את הקצוות על חימר הדוגמנות, ואבטחו אותם בלחץ עדין. לאחר מכן, שיתקו את היתושים על ידי הסרת רגליהם וכנפיהם.תקן את היתושים לסרט שמעל קצות המסנן. הנח בעדינות את הפרובוסקיס של כל יתוש לקצה מסנן. לאחר 30 דקות, הסר את קצות המסנן והשליך את החימר והסרט.העבירו את הרוק שנאסף לצינורות תגובה המכילים 10 מיקרוליטר PBS. מערבבים בעדינות את הרוק וה-PBS, ומעבירים את התערובת לבארות של צלחת של 96 בארות. דגרו את הצלחת במשך שבעה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.בעזרת מיקרוסקופ אור, בדוק את התאים אם יש אפקט ציטופתי. ברגע שבאר חיובית להשפעה ציטופתית, השתמש בפיפטה כדי לקצור 140 מיקרוליטר של הסופרנטנט. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה.לאחר מכן, מערבבים 140 מיקרוליטר של הסופרנטנט עם 560 מיקרוליטר של מאגר AVL, ודוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, הוסף 560 מיקרוליטר אתנול, והפוך את הדגימה לערבוב. באמצעות פרוטוקול זה, נבדקו מספר מיני יתושים לזיהום והעברה של נגיף הזיקה בתנאי אקלים שונים.בתנאי דגירה של 27 מעלות צלזיוס כל מיני האדס הראו רוק חיובי לנגיף זיקה. לעומת זאת, אף אחת מדגימות הרוק מטקסוני הקולקס לא הכילה עדות לנגיף. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו עבור 50 יתושים בשעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויי רוק בכפייה. אל תשכח שעבודה עם יתושים נגועים עלולה להיות מסוכנת מאוד, ולכן תמיד יש לנקוט באמצעי בטיחות מיוחדים לטיפול ביתושים בתנאי BSA-3 בעת ביצוע כל ניסוי.

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל...

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים בודדים מעיים יתוש, כולל בידוד וזיהוי של חיידקים midgut יתושים, דלדול אנטיביוטיקה של חיידקים מעיים יתוש, ולהחזן מחדש מין אחד חיידקים ספציפיים.

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בצמח המארח כדי לזהות חלבוני רוק של חלבונים נגיפיים צמחיים וחלבונים נגיפיים צמחיים המשתחררים על ידי וקטורי עלים.

איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

למד את שיטת ההכרחה לניתוח מיומנות וקטור של יתושי Aedes albopictus ו-Culex לנשיאת וירוס זיקה. שיטה זו מאפשרת בדיקה בו-זמנית של עד 50 יתושים בשעה אחת ללא שימוש בבעלי חיים במעבדה.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

גלה סרטונים נוספים